1. إعداد المجهر واكتساب الزمن
ملاحظة: تم تطوير البروتوكول الموضح هنا لمجهر واسع المجال مقلوب مع تركيز تلقائي، وهدف زيت PH3 بقياس 100X/1.30 NA، ومرحلة محركية بنظام X و Y، وكاميرا sCMOS، ومصدر ضوء، ومرشحات للبروتينات الفلورية الخضراء، أو الفلورية الحمراء، أو الفلورية الصفراء، وغرفة حضانة تحكم في درجة الحرارة. تحافظ هذه الحجرة على حماية الخلايا من الضوء وعند درجة حرارة ثابتة.
- قم بتسخين غرفة الحضانة والمجهر إلى 32 درجة مئوية لمدة ~1 - 2 ساعة قبل بدء المجهر.
ملاحظة: اعتمادا على إعداد المجهر، قد يستغرق التسخين وقتا أطول. التسخين المسبق ضروري لتقليل الانحراف وتثبيت نظام التحكم في التركيز التلقائي. - شغل المجهر وبدأ برنامج التحكم في المجهر. اختر الهدف الصحيح والمرايا والفلاتر المناسبة لالتقاط صور تباين الطور بالإضافة إلى صور البروتينات الفلورية الخضراء، الفلورية الحمراء، أو الفلورية الصفراء.
ملاحظة: عادة ما يزود المجهر ببرامج مفضلة للتحكم في المجهر والتقاط الصور. هنا، تم استخدام برنامج تجاري متوفر (انظر جدول المواد) للتحكم في المجهر والتقاط الصور. - أضف قطرة من زيت الغمر عالي الجودة إلى العدسة الموضوعية وفي قاع العينة، معبأة مسبقا عند 32 درجة مئوية. ضع العينة في أدنى موضع Z ممكن لتجنب إتلافها عند وضع العينة على مرحلة المجهر. ضع الإطار المعدني مع العينة على مرحلة المجهر، مع "جانب الثقب" باتجاه الهدف. ثبت العينة بإحكام في حامل المسرح.
- ركز على الخلايا عن طريق تحريك المرحلة في اتجاه Z أقرب إلى الهدف. حرك المرحلة ببطء عندما يسقط الزيت على الجانب السفلي من العينة وتلامس العدسة الموضوعية. حرك المرحلة في اتجاه X/Y حتى تظهر عدة خلايا منفردة في منطقة الرؤية، عندما تكون الخلايا في المستوى البؤري. تأكد من وجود ميكروسفير فلوري واحد على الأقل في منطقة العرض لمحاذاة الصور المكتسبة لاحقا.
ملاحظة: في الظروف المثلى، يجب الوصول إلى كثافة خلايا تتراوح بين 15 - 30 خلية في كل منطقة رؤية (2,048 × 2,048 بكسل أو 133.1 × 133.1 ميكرومتر). - افتح معالج الاستحواذ متعدد الأبعاد لبرنامج التحكم في المجهر لإعداد تجربة تايم لابس تسمح للمجهر بالتقاط صور عند أطوال موجية ومواقع مراحل متعددة إذا لزم الأمر.
- في التبويب الرئيسي، فعل Timelapse وعدة أطوال موجية. ستظهر علامات تبويب إضافية على الجانب الأيسر من النافذة.
- انقر على تبويب الحفظ واختر الدليل لاختيار مجلد فارغ على القرص الصلب للكمبيوتر لحفظ الصور التي تم الحصول عليها. فعل اسم الأساس التزاوي إذا كان هناك ملف موجود للتأكد من أن مجموعات البيانات المتتالية لا تكتب فوق المجموعات السابقة. ثم أعط التجربة اسما مع التاريخ واسم السلالة أو عنوان التجربة.
- انقر على تبويب التايم لابس لضبط معلمات التايم لابس. اضبط المدة على 24 ساعة وحدد الفترة الزمنية على 20 دقيقة. عدد نقاط الوقت سيتغير تلقائيا.
ملاحظة: تعتمد الفترة الزمنية المثلى على التجربة ووظيفة الخلية التي سيتم تحليلها. قد يؤدي التقاط الصور بشكل متكرر إلى تبييض ضوئي. لذا، يجب إيجاد مقايضة بين الدقة الزمنية والتبييض الضوئي بشكل تجريبي. عند وقت مضاعفة يتراوح بين 4 - 6 ساعات، يمكن التقاط الصور بسهولة بفاصل 5 دقائق (أو حتى فترات أصغر إذا رغب الأمر) لمجهر التباين الطوري. إذا كان من المرغوب استخدام المجهر الفلوري على مدى 24 ساعة، يجب تسجيل الصور بفاصل تقارب 15 إلى 30 دقيقة. - انقر على تبويب Wavelengths . اختر عدد الأطوال الموجية التي يجب الحصول عليها لكل صورة في كل نقطة زمنية عن طريق تغيير الرقم.
ملاحظة: لكل طول موجي، سيظهر تبويب جديد على الجانب الأيسر من ساحر الاستحواذ متعدد الأبعاد، وسيتم الحصول على الأطوال الموجية بالترتيب من الأعلى إلى الأسفل. لكل طول موجي، يمكن تعديل إعدادات الاستحواذ بشكل منفصل. - انقر على أول علامة تبويب طول موجة من الأعلى. اختر تباين الطور في قائمة الإضاءة . اختر 100 مللي ثانية للتعريض واختر كل نقطة زمنية في قائمة الاكتساب . قم بتعطيل التعريض التلقائي باختيار Never في القائمة المنسدلة.
- كرر الخطوة 3.5.5 لكل طول موجي يجب اكتسابه في كل نقطة زمنية. بالنسبة للإعداد التجريبي والبروتينات الموسومة بالفلورية الموضحة هنا، استخدم المعايير التالية للتعرض: 250 مللي ثانية لبروتينات الاندماج mCheries، 200 مللي ثانية لبروتينات الاندماج YFP (بروتين فلورسنت أصفر)، و1,000 مللي ثانية لبروتينات الاندماج GFP (بروتين فلورية أخضر).
ملاحظة: يجب تحديد إعدادات الإضاءة المثلى لكل سلالة وبروتين فلوري مسبقا عن طريق تغيير شدة المصباح ووقت التقاط الصورة لكل طول موجي. أوقات التقاط الصور الطويلة جدا ستزيد من تأثير السم الضوئي وفي النهاية تؤدي إلى توقف النمو وموت الخلايا. لذلك، يجب تحقيق مقايضة بين جودة الصورة وصلاحية الخلية. - التقاط صور من عدة مواقع مراحل لزيادة عدد الخلايا المسجلة في نفس التجربة.
- للحصول على صور من مواقع مراحل متعددة، قم بتفعيل مواقع مراحل متعددة في التبويب الرئيسي . ثم انقر على تبويب المسرح وزر البث المباشر للنظر إلى مجال الرؤية.
- حرك المرحلة في اتجاه X/Y حتى يصبح مجال الاهتمام (ROI) في مجال الرؤية. حفظ إحداثيات X و Y بالنقر على "+" في تبويب المرحلة . حرك المرحلة مرة أخرى في اتجاه X/Y حتى يتم العثور على عائد جديد واحفظ الإحداثيات مرة أخرى بالنقر على "+". تابع حتى يتم حفظ عدد المناطق المطلوبة.
ملاحظة: في حالة التقاط صور الفلورة، تأكد من أن المناطق ذات الاهتمام (ROIs) ليست قريبة جدا من بعضها لتقليل السمية الضوئية.
- تحقق مرة أخرى من أن الخلايا في بؤرة التركيز بالنقر على مواقع X و Y المحفوظة المختلفة، وابدأ التركيز التلقائي على الأجهزة بالضغط على الضغط على AFC مع الاستمرار للحفاظ على ثبات موضع Z المحفوظ طوال التجربة.
- ابدأ تسجيلات الزمن في برنامج التحكم بالمجهر بالنقر على الحصول في معالج الاستحواذ متعدد الأبعاد .
ملاحظة: ستظهر نافذة لكل طول موجي مكتسب، وستظهر نافذة إضافية تظهر عدد نقاط الزمن المكتسبة والوقت حتى التقاط الصورة التالية. - تحقق من أن الخلايا لا تزال في بؤرة التركيز بعد النقاط الزمنية الأولى في تسجيلات التايم لابس لتعظيم جودة الصور وإعادة التركيز إذا لزم الأمر.