تصوير الخلايا الحية بتقنية التايم لابس لافتراس بكتيريا Bdellovibrio على الإشريكية القولونية

الملخص

المصدر: ماكوفسكي، ل.، وآخرون. تصوير الخلايا الحية لدورة حياة المفترس البكتيري Bdellovibrio بكتيريوفوروس باستخدام مجهر الفلورة الزمنية المتقطعة. J. Vis. Exp. (2020)

يظهر هذا الفيديو تصوير التألق الزمني لبكتيريا Bdellovibrio وهو يفترس الإشريكية القولونية الثابتة تحت وسادة أغاروز، مما يتيح التصوير اللحظي للتكاثر داخل الخلايا وإطلاق النسل لدراسة الافتراس البكتيري وتفاعلات الممرض بين المضيف.

البروتوكول

1. توصيل المجهر الفلوري الزمني

1. ضع الطبق بحجم 35 مم في حامل أطباق بتري بحيث لا يتحرك أثناء التجربة. ضع قطرة واحدة من زيت الغمر (1.518 معامل انكسار) على الهدف وكذلك على أسفل الطبق بحجم 35 مم.
2. قم بتركيب الحامل على مرحلة المجهر المقلوب في غرفة المجهر.
3. قم بإعداد الخيارات في برنامج التحكم في المجهر لجمع صور متعددة في مواقع مراحل متعددة على مدى الزمن.
   1. اضبط التكبير (100x) والعدسة متعددة الألوان (GFP (بروتين فلوري أخضر)/mCherry). باستخدام عدسة عين وحقل إضاءة (BF)، ابحث عن مستوى البؤرة وافتح مدير قائمة النقاط.
   2. اختر على الأقل 10 مواقع ذات اهتمام عن طريق تحريك المرحلة وتخزين الإحداثيات لكل موقع في برنامج المجهر بالنقر على زر علامة النقطة . تجنب الأماكن القريبة من بعضها لمنع التبييض الضوئي والسمية الضوئية. قم بتدوير صمام الكاميرا من العدسة إلى الشاشة وضبط معايرة كل نقطة عن طريق ضبط مستوى البؤرة والنقر على زر استبدال النقطة في مدير قائمة النقاط.
   3. افتح مصمم التجربة وقم بتعيين جميع معلمات التجربة في كل تبويب كما يلي:
      1. قم بإلغاء علامة صندوق التكديس Z .
      2. اختر قنوات الفلورسنت واضبط إعدادات الإضاءة المثلى. هنا، تم استخدام الإعدادات التالية: لقناة mCherry، مجموعات مرشحات mCherry (EX575/25؛ EM625/45)، شدة 50٪، ووقت تعريض 200 مللي ثانية؛ بالنسبة لقناة GFP، مجموعة مرشح GFP (EX475/28؛ EM525/48)، شدة 50٪، و80 مللي ثانية؛ وبالنسبة لصور BF، قناة POL بشدة 5٪ و50 مللي ثانية.
      3. اختر الفترات بين التقاط الصور والوقت الإجمالي للتجربة. هنا، تم إجراء فترات زمنية مدتها 5 دقائق خلال فترة التجربة التي استمرت 10 ساعات.
      4. تمكين صيانة التركيز للمواقع المختارة (للنظام المستخدم هنا، عن طريق وضع علامة الحفاظ على التركيز باستخدام مربع UltimateFocus ).
      5. اختر مجلد البيانات الذي يجب حفظ ملفات الصور فيه تلقائيا.
      6. أعد فحص جميع الإعدادات في التحكم في برنامج المجهر، ثم ابدأ تجربة التايم لابس.
4. بعد الساعة الأولى من التجربة، تحقق من أن جميع مواقع المسرح لا تزال في بؤرة التركيز. قم بضبط التركيز خلال الفترات الزمنية بين التقاط الصورة، إذا لزم الأمر.
5. عند الانتهاء من تجربة التايم لابس، أزل طبق بتري واستخدم طبق 35 مم مع وسادة أغاروز وفقا لبروتوكول السلامة البيولوجية.
   ملاحظة: جميع الخطوات الفرعية بعد الخطوة 1.2 مخصصة لمستخدمي DeltaVision Elite. يحتاج الباحثون الذين يستخدمون أنظمة أخرى إلى تعديل الإعدادات وفقا للأنظمة الفردية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
علم الأحياء الجزيئي المعتمد أغاروز	بيو-راد	161-3100	أجوروز منخفض الفلورة لمنطقة الأغاروز
فيجي	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	حزمة معالجة الصور مفتوحة المصدر
طبق زجاجي قاع 35 مم	إيبيدي	81218-200	الزجاج غير المطلي
المجهر	GE	دلتا فيجن إيليت	مرحلة Microtiter، وحدة ليزر التركيز النهائي، كاميرا DV Elite CoolSnap HQ2، SSI تجميع FP DV، مجموعة أوبجي. زيت أولي 100x 1.4 NA، منشور Nomarski 100x LWD DIC، ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240V
ابدأ سوفت ووركس	GE		برامج التصوير الموردة من الشركة المصنعة