تصور توزيع البروتين البكتيري في ثلاثة أبعاد باستخدام التصوير الفلوري

الملخص

المصدر: براتون، ب. ب. وآخرون، التصوير ثلاثي الأبعاد للخلايا البكتيرية لتمثيلات خلوية دقيقة وتحديد مواقع دقيقة للبروتين. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو الطريقة لالتقاط وتحليل صور الفلورة ثلاثية الأبعاد لخلايا البكتيريا لدراسة تنظيم البروتين على مستوى الخلية الواحدة.

البروتوكول

1. التصوير

1. أدخل الشريحة المغلقة على المجهر واتركها تبقى لمدة 5 دقائق لتوازن درجة الحرارة مع المحيط. قد تكون غرفة المجهر في درجة حرارة مختلفة عن غرفة تحضير العينات.
2. خذ مكدس Z فلوري من العينة.
   ملاحظة: يجب أن تغطي مجموعة z العينة بالكامل مع تباعدة z أقل من عمق المجال. بالنسبة لخلايا هدف 1.45 NA 100x وكثافة ~1 ميكرومتر من E. coli ، تعمل 40 خطوة بسرعة 100 نانومتر في كل خطوة بشكل جيد. بالنسبة للخلايا الكبيرة أو الخلايا التي لا تكون مسطحة تماما على السطح، قد تكون هناك حاجة لأكثر من 50 خطوة. أضف خطوات كافية وتأكد من أن العينة مشوشة بالكامل من فوق وتحت.
   1. استخدم البرنامج المرتبط بالمجهر (انظر جدول المواد) للتحكم في المجهر.
   2. ركز على منتصف الخلية باستخدام عجلات تركيز المجهر. تحت استحواذ ND، حدد مربع Z لأخذ مجموعة z-stack. انقر على زر الصفحة الرئيسية لتعيين منتصف الخلية كنقطة بداية. اضبط حجم الخطوة إلى 0.1 ميكرومتر واضبط النطاق إلى 4 ميكرومتر. تأكد من أن جهاز Z مضبوط على مرحلة البيزو.
   3. اضبط قنوات الفلورسنت تحت نافذة لامبدا على إعدادات الجزيئات الفلورية التي يتم تصويرها. في هذه التجربة، تم استخدام GFP وmCherry.
      ملاحظة: خذ مكدس z إضافي بنفس حجم ونطاق الخطوة في قناة الألوان الثانية إذا كان التوزيع ثلاثي الأبعاد لقناة فلورية إضافية مطلوبا. في هذه التجربة، استخدم mCherry السيتوبلازمي لتحديد شكل الخلية، بينما استخدم MreB-GFP كقناة لونية ثانية.
   4. تأكد من أن ترتيب التجربة مضبوط على لامبدا (سلسلة z) بحيث يأخذ مكدس z كامل في كل قناة ألوان قبل التبديل.
   5. انقر على تشغيل الآن لبدء جمع الصور وحفظ الملف بمجرد اكتمال مكدس z أو كلتاهما.
   6. انتقل إلى منطقة جديدة على اللوحة وكرر الخطوات 1.2.2-1.2.5.

2. إعادة بناء الخلايا

1. قم بقص الخلايا الفردية وحفظ الصور كملف tiff مكدس بحيث يكون هناك خلية واحدة فقط لكل ملف. تأكد من أن هذه الخلية معزولة جيدا عن أي خلايا أخرى (أي تقريبا 5 أضعاف نصف الحد الأقصى الكامل لدالة التمويه في xy).
   ملاحظة: يمكن القيام بذلك باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة مجانا (انظر جدول المواد).
   1. ارسم مربعا حول خلية فردية وكرر تلك الخلية مرتين، مرة واحدة لكل قناة. تأكد من تحديد مربع التكرار الفائق وغير القناة إلى 1 أو 2، مع التأكد من أن الشرائح تشمل كامل ال z-stack.
      ملاحظة: إذا تم تصوير شكل الخلايا فقط وليس بروتين فلوري إضافي، فسيكون هناك قناة واحدة فقط.
   2. بمجرد توفر كلا المجموعتين، انتقل إلى الصور | الأكوام | الأدوات | قم بدمج الصور مع قناة البروتين أولا وقناة الشكل ثانيا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغاروز	سيغما-ألدريتش	A9539
مسحة قطنية	شركة بيوريتان للمنتجات الطبية ذات المسؤولية المحدودة	S304659	اعتدت على الزائدة الزائدة في VaLaP
انزلاق الغطاء	VWR	16004-302
فيجي	ImageJ	https://fiji.sc	تستخدم في كروز الخلايا
لانولين	سيغما-ألدرتش	L7387	امزج مع البرافين ومركبة البترول لصنع VaLaP
متوسط نمو LB	بي دي ديفكو	DF0446173
M63 متوسط	الولايات المتحدة البيولوجية	M1015
ماتلاب	ماث ووركس		كان مطلوبا لتشغيل سكريبتات الالتفاف للأمام
شرائح المجهر	فيشر	12-550-133
عناصر جهاز الأمن الوطني	نكون
البارافين	سيغما-ألدرتش	327212
هلام البترول	إيكويت	49035-038-27
مرحلة بيزو ز	نيكون	77011589
نصائح المحرف -p200	يو إس إيه ساينتيفك	1111-0730
نصائح البيبيت - ص10	يو إس إيه ساينتيفك	1111-3730