قياس كمية البكتيريا المعوية في أسماك الزرد المصابة بمرض فيبريو كوليرا

الملخص

المصدر: ناج، د.، وآخرون. قياس استيطان وإسهال Vibrio cholerae في نموذج سمك الزرد البالغ. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو بروتوكول لقياس الحمل البكتيري المعوي في أسماك الزرد البالغة المصابة بسلالة مقاومة للمضادات الحيوية من فيبريو كوليرا. بعد القتل الرحيم والتشريح، يتم عزل الجهاز الهضمي وتجانسه باستخدام خرز زجاجي، ومعالجته لإطلاق البكتيريا. يتم طلاء النظير المتجانس الناتج على وسط انتقائي، وتعد مستعمرات زرقاء اللون تعبر عن β-جالاكتوسيداز لتقدير العبء البكتيري.

البروتوكول

1. تحديد مستويات الاستعمار المعوي

ملاحظة: يعد الاستعمار المعوي المقياس الأكثر فائدة في نموذج سمك الزرد، حيث يمكن استخدامه لمقارنة اللياقة النسبية لسلالات مختلفة من V. cholerae أو تأثيرات الطفرات أو التغيرات الجينية.

1. القتل الرحيم

1. عندما تصل التجربة إلى النقطة المطلوبة، خذ عينة من ماء العدوى (عادة ما يكون 15 مل كافيا) للسماح بإخراج البكتيريا وقياس الإسهال (مثل اختبار الموسين، محتوى البروتين، و/أو الجرعة الزائدة) إذا رغبت في ذلك.

2. صب بقية الماء عبر شبكة صيد (لجمع الأسماك) إلى مبيض لقتل V. cholerae في الماء.

3. ضع السمكة في كأس يحتوي على ماء ملوث بالإضافة إلى 336 ميكروغرام/مل من إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانيسلفونات (تريكين) وحضن السمك في هذا المحلول التريكايني لمدة 20 دقيقة عند RT.
ملاحظة: تم تعقيم الشبك بمحلول مبيض بنسبة 10٪.

2. التشريح

1. تحضير الأسماك

1. استخرج سمكة من محلول التريكاين بملعقة بلاستيكية قابلة للتخلص منها وضعها على سطح التشريح.

2. ضع السمكة بحيث يكون جانبها البطني متجها للأعلى وثبتها عبر الفك السفلي، مع توجيه الطرف غير الواضح للدبوس بعيدا عن مركز الجسم. ضع دبوسا آخر خلف فتحة الشرج، أيضا مائلة بعيدا عن الجسم.

2. التعرض للأمعاء

1. مسح السطح السفلي للسمكة بمنديل خال من الوبر مغموس بنسبة 70٪ إيثانول.

2. تعقيم المشرط ومقص فاناس عن طريق غمسهما في 70٪ إيثانول وحرقهما.

3. قم بعمل شق صغير طوليا في البطن تحت الجلد مباشرة عن طريق اختراق القشور واستخدام المشرط. كن حذرا من القطع بعمق، لأن الجهاز الهضمي يقع تحت الجلد مباشرة.

4. باستخدام المقص، قم بتمديد الشق بحذر على طول الجسم، بحيث لا يقطع أعمق من مستوى الجلد وتجنب فتحة الشرج.

5. قم بقطعين جانبيين بالمقص باتجاه رأس السمكة للسماح بفتح الشق.

6. ثبت الجلد على جانبي الشقوق الجانبية على سطح التشريح، مع توجيه الدبابيس بعيدا عن الجسم.

ملاحظة: كانت أطراف الدبابيس تعقم سابقا عن طريق إشعالها بالكحول.

3. إزالة الجهاز الهضمي

ملاحظة: يجب أن يكون الجهاز الهضمي مرئيا كأنبوب شاحب ورفيع جدا فوق الأعضاء الأخرى.

1. تعقيم الملقط بالنار ثم استخدمها لإزالة كامل الجهاز الهضمي (عادة بطول 12–15 مم). ضع الأمعاء في أنبوب تجانس يحتوي على خرزات زجاجية (انظر الخطوات 1.3.1–1.3.2) و1 مل من 1x PBS أو LB، على الثلج.

3. التجانس

1. جهز أنابيب التجانس مسبقا عن طريق صب ~1.5 جرام من خرز زجاجي بقطر 1 مم في أنابيب غطاء لولبي بحجم 2 مل (ملؤها تقريبا إلى النصف) ثم تعقيمها عن طريق التلقيم التلقائي.

2. أضف 1 مل من زيت LB المعقم أو 1x PBS.

3. بعد إضافة أمعاء سمك الزرد (الخطوة 1.2.3.1) إلى الأنابيب، قم بتثبيت الأغطية بإحكام شديد، ثم ثبت الأنابيب في موحش الدوامة.

4. توحيد العينات لمدة دقيقة واحدة على أقصى إعداد، ثم بردها على الثلج لمدة 1–2 دقيقة. كرر دورة التجانس هذه مرة أخرى للحصول على توحيد كامل. ملاحظة: عدة طرق بديلة للتجانس ستعمل أيضا.

4. قياس مستويات الاستعمار المعوي

1. تحضير أنابيب (سواء كانت أنابيب اختبار زجاجية صغيرة أو أنابيب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل) لتخفيف التجانس التسلسلي بإضافة 900 ميكرولتر من LB أو 1x PBS لكل أنبوب. لكل سمكة، جهز 5–6 أنابيب وقم بتخفيفات تسلسلية 10 مرات من التجانس المعوي بإضافة 100 ميكرولتر من التجانس إلى الأنبوب الأول، ثم دمجه للخلط، ثم إضافة 100 ميكرولتر من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الثاني.

2. كرر هذه العملية حتى يتم تجهيز جميع التخفيفات.

3. صفائح بحجم 100–200 ميكرولتر من كل تخفيف على صفائح LB أجار تحتوي على 100 ميكروغرام/مل من الستربتوميسين (إذا استخدمت سلالات مقاومة للستريبتوميسين) و40 ميكروغرام/مل من X-غال (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-β-D-جالاكتوبيرانوسايد). حضن الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة 16–18 ساعة.

4. بعد الحضانة الليلية، عد مستعمرات V. cholerae على الأطباق، إما باستخدام عداد المستعمرات الآلي أو عد المستعمرات يدويا؛ من المفيد وضع علامة على المستعمرات التي تم عدها بطرف العلامة.

5. تحديد الوحدة الخالية من الرطوبة لكل أمعاء السمك عن طريق ضرب عدد الألواح في عامل تخفيف التعليق، مع الأخذ في الاعتبار الحجم الذي تم تغطيته.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الآلة
حاضنة الهزاز	نيو برونزويك ساينتفيك، إديسون، نيوجيرسي	إكسيلا E25
الحاضنة	نوير، بليموث، مينيسوتا	التدفق التلقائي
مقياس الطيف الفوتوني	ثيرمو، والثام، ماساتشوستس	جيسيس 6
متجانس الدوامة	ميني بيدبيتر24	112011
آلة الوزن	أوهاوس، كولومبيا، ماريلاند	المغامرة المحترفة
منشط الحرارة	كورنينغ، كورنينغ، نيويورك	PC-420D
الموقد
عداد المستعمرات الآلي	REVSCI	120417B
المواد
كؤوس زجاجية بسعة 400 مل	بايركس
الأغطية المثقبة	حامل النصيحة الدقيقة مع ثقوب من صندوق البقشيش
ملاعق بلاستيكية ذات مرة واحدة	أوفيس ديبوت، بوكا راتون، فلوريدا	D15-25-7008
نظام حوض الأسماك	أكواينيرينغ، سان دييغو، كاليفورنيا
جهاز تنقية المياه RO	أكوا إكس إكس	TK001
شبكة صيد	مارينا
طعام الأسماك	تترا فين
روبيان المالح	علامة ريد جنغل	O.S.I. برو 80
لوح الستايروفوم
الدبابيس
المشرطات	أدوات علمية ممتازة، مدينة فوستر، كاليفورنيا	10000-10
الملقط	أدوات علمية ممتازة، مدينة فوستر، كاليفورنيا	11223-20
مقص فاناس	أدوات علمية ممتازة، مدينة فوستر، كاليفورنيا	15000-11
أنابيب غطاء برغي بحجم 2 مل	فيشر ساينتفيك، هامبتون، نيو هامبشاير	02-681-375
خرز زجاجي بقطر 1 مم	المواصفة الحيوية	11079110
خرز زجاجي للنشر	سيغما، سانت لويس، ميزوري	18406-500G
لوحة بتري	فيشر براند، هامبتون، نيوهامبشاير	FB0875713
أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل	ميدساي، فالي بارك، ميزوري	AVSS1700
أنبوب طرد مركزي بسعة 50 مل	كورنينغ فالكون، كورنينغ، نيويورك	352098
أنابيب الاختبار	بايركس	9820
زجاج البيبيت	فيشر براند، هامبتون، نيوهامبشاير	13675K
الماصات الدقيقة	سارتوريوس بيوهيت، غوتنغن، ألمانيا	M1000/M200/M20
نصائح	جينيسي ساينتيفيك، سان دييغو، كاليفورنيا	24-150RS/24-412
المواد الكيميائية
أملاح المحيط الفورية
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	VWR علوم الحياة، رادنور، بنسلفانيا	K813-500ml
تريكائين (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانيسلفونات	سيغما، سانت لويس، ميزوري	A5040
LB متوسط
NaCl	فيشر ساينتفيك، هامبتون، نيو هامبشاير	BP358-212
أغار	كلية العلوم الحيوية في كلية الأعمال، سان خوسيه، كاليفورنيا	214010
تي سي بي إس أغار	كلية العلوم الحيوية في كلية الأعمال، سان خوسيه، كاليفورنيا	265020
DCLS أغار	سيغما، سانت لويس، ميزوري	70135-500 جرام
البرمجيات
مايكروسوفت أوفيس
منشور 5