استعمار الأمعاء وتحفيز الإسهال بواسطة Vibrio cholerae في أسماك الزرد البالغة

الملخص

المصدر: ناج، د.، et.al. قياس استيطان وإسهال Vibrio cholerae في نموذج سمك الزرد البالغ. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تطعيم سمك الزرد البالغ بسلالة فيبريو كوليرا الممرضة لدراسة استعمار الأمعاء ونتائج الأمراض. يظهر كيف تعطل السموم البكتيرية سلامة الأمعاء، مما يؤدي إلى تسرب السوائل، وإفراز المخاط، والإسهال المائي قبل تجهيز الأسماك لمزيد من التحليل.

البروتوكول

1. تلقيح سمك الزرد بالغمر
   ملاحظة: يشبه هذا التعرض المسار الطبيعي للعدوى.
   1. تحضير فيبريو كوليرا
      1. قم بتلقيح 5 مل من مرق الليسوجيني (LB) بمستعمرة معزولة من V. cholerae من صفيحة LB وحضنها عند 37 درجة مئوية مع هز (180 دورة في الدقيقة) لمدة 6–8 ساعات (زراعة ليلية).
      2. تلقيح 25 مل من وسط LB الطازج المعقم في قارورة مخروطية بحجم 250 مل مع 50 ميكرولتر من الزراعة المذكورة أعلاه خلال الليل. حضنه لمدة 16–18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الرج (150 دورة في الدقيقة).
      3. اقرأ الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (_{OD 600}) من تخفيفة 1/10 للزراعة الليلية لتقدير عدد البكتيريا لكل مل (OD₆₀₀ = 1 هو ~10⁹ CFU/mL).
      4. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6000 جرام لمدة 10 دقائق. أزل الوسط باستخدام ماصة أو اسكبها في محلول مطهر. أعد تعليق الخلايا في PBS المعقم إلى التركيز المطلوب، عادة بين 1 ×^{10 7} إلى 1 × 10¹⁰ لكل مل من PBS.
         ملاحظة: هنا، نشير إلى مياه التناضح العكسي المعبدة التي تحتوي على 60 ملغ/لتر من أملاح البحر على أنها مياه عدوى معقمة.
   2. التطعيم والحضانة
      1. ضع أربع أو خمس أسماك زرد في كأس بسعة 400 مل يحتوي على 200 مل من ماء العدوى المعقم.
      2. أضف 1 مل من V. cholerae للحصول على تركيز العدوى المطلوب (عادة 5 × 10^{4 إلى 5} ×^{10 7} وحدة CFU/مل) في 200 مل من ماء العدوى.
      3. غط الكأس بغطاء مثقب لمنع السمكة من القفز للخارج؛ الجزء العلوي من صندوق البقشيش بسعة 200 ميكرولتر يعمل جيدا لهذا الغرض.
      4. ضع علامة على كل كأس ووضعها في حاضنة زجاجية مضبوطة على درجة حرارة 28 درجة مئوية طوال مدة التجربة.
   3. إجراء التعرض العابر
      ملاحظة: التعرض العابر ل V. cholerae (عادة 6 ساعات) يليه إزالة البكتيريا الملقحة مفيد لدراسة انتقال العدوى ولقياس كمية البكتيريا المفرزة بدقة.
      1. بعد 6 ساعات من التعرض، صب ماء الكأس عبر شبكة صيد لجمع الأسماك. تخلص من الماء الملوث في حاوية مبيضة لقتل V. cholerae.
      2. ضع السمكة المستخرجة في كأس يحتوي على 200 مل من ماء العدوى المعقم. دع الأسماك تسبح في هذا الماء النظيف لمدة 5 دقائق لإزالة البكتيريا السطحية من السمكة.
      3. كرر إجراء الشبكة وضع السمك في كأس جديد بماء معقم بسعة 200 مل. أبق السمك في هذا الكأس طوال مدة التجربة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الآلة
الحاضنة	نوير، بليموث، مينيسوتا	التدفق التلقائي
المواد
كؤوس زجاجية بسعة 400 مل	بايركس
الأغطية المثقبة	حامل النصيحة الدقيقة مع ثقوب من صندوق البقشيش
نظام حوض الأسماك	أكواينيرينغ، سان دييغو، كاليفورنيا
جهاز تنقية المياه RO	أكوا إكس إكس	TK001
شبكة صيد	مارينا
طعام الأسماك	تترا فين
لوحة بتري	فيشر براند، هامبتون، نيوهامبشاير	FB0875713
أنبوب طرد مركزي بسعة 1.5 مل	ميدساي، فالي بارك، ميزوري	AVSS1700
أنابيب الاختبار	بايركس	9820
الماصات الدقيقة	سارتوريوس بيوهيت، غوتنغن، ألمانيا	M1000/M200/M20
نصائح	جينيسي ساينتيفيك، سان دييغو، كاليفورنيا	24-150RS/24-412
LB متوسط
تريبتون	كلية العلوم الحيوية في كلية الأعمال، سان خوسيه، كاليفورنيا	211705
مستخلص الخميرة	كلية العلوم الحيوية في كلية الأعمال، سان خوسيه، كاليفورنيا	212750
NaCl	فيشر ساينتفيك، هامبتون، نيو هامبشاير	BP358-212
أغار	كلية العلوم الحيوية في كلية الأعمال، سان خوسيه، كاليفورنيا	214010