$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
1. تحضير زراعة السالمونيلا التيفيموريوم ΔROA لزراعة الفم للفئران
- من مخزون الجلسرون المجمد من S. Typhimurium ΔAroA، جهز صفيحة مخطط باستخدام أجار لوريا-بيرتاني (LB agar) يحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين مع حلقة تلقيح معقمة. الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية. يمكن تخزين صفائح السلسلة حتى أسبوع واحد عند 4 درجات مئوية.
- قبل يوم واحد من العدوى، حضر المضاد الحيوي عن طريق إذابة 0.5 جرام من الستربتوميسين في 2.5 مل من الماء. بعد تعقيم محلول الستربتومايسين بالتصفية، قم بتعقيم الفئران عن طريق الفم باستخدام إبرة جافاج 22 جرام ذات رأس بلب وحقنة 1 مل مع 100 ميكرولتر من محلول الستربتوميسين (20 ملغ من الستربتومايسين لكل جرعة). باستخدام حلقة تلقيح، قم بتلقيح 3 مل من مرق LB (50 ميكروغرام/ملتر ستريبتومايسين) في أنبوب زراعة مع مستعمرة واحدة. احتضن زراعة السالمونيلا هوائيا عند 37 درجة مئوية خلال الليل مع هز بمعدل 200 دورة في الدقيقة (RPM).
- في يوم العدوى، جهز الجرعة النهائية من العدوى عن طريق إجراء تخفيفين متتاليين بنسبة 1/10 من زراعة السالمونيلا الليلية في محلول ملحي فوسفوري معقم (PBS). ينتج عن ذلك لقاح بسعة 100 ميكرولتر يحتوي تقريبا على 3 × 106 وحدات تشكيل مستعمرات (CFU).
- باستخدام إبرة جافاج برأس مصباحي بطول 22 جرام وحقنة بسعة 1 مل، قم بتغبيس كل فأر ب 100 ميكرولتر من السالمونيلا المحضرة.
ملاحظة: حضر مزارع السالمونيلا باستخدام تقنيات المعقمات. يمكن التحقق من التركيز النهائي للتطعيم للسالمونيلا عن طريق طلاء التخفيفات المتكررة على LB Agar باستخدام الستربتومايسين.
2. تقييم أعباء السالمونيلا في الأنسجة
- جهز أنابيب دقيقة دائرية بسعة 2 مل من القفل الآمن والقاع المستدير مع 1 مل من PBS المعقمة وخرزة فولاذية مقاوم للصدأ معقمة بحجم 2 مل. قم بوزن الأنابيب مسبقا قبل جمع الأنسجة.
- استئصال الأنسجة المخروطية والطحالية من الفئران التي تم قتلها بسبب التعرض لثاني أكسيد الكربون. اجمع الأنسجة من الحيوانات الفردية في أنابيب منفصلة. وزن الأنابيب لتحديد أوزان الأنسجة.
- قم بالتجانس باستخدام جهاز مطحنة الخلاط لمدة 15 دقيقة عند 30 هرتز. انقل 900 ميكرولتر من PBS لكل بئر في كتلة بسعة 2 مل بحجم 96 بئئ. تتجانس 100 ميكرولتر من الأنسجة في البئر الأول، وتخلط جيدا، وتقوم بتخفيف متسلسلات بإضافة 100 ميكرولتر إلى الآبار التالية حتى يتم الحصول على تخفيف بمقدار 10⁻⁶. طبق 10 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاث نسخ على LB Agar يحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستريبتومايسين.
- يعد وضرب متوسط وحدة التخفيف الاستهلاكية بمقدار 100 لأن 10 ميكرولتر من عينة 1000 ميكرولتر تم طلاؤها، وعامل التخفيف المناسب. اقسم وزن النسيج الكلي CFU على أوزان الأنسجة لتحديد CFU لكل جرام من النسيج.
ملاحظة: احتفظ بجميع العينات على الثلج أو عند 4 درجات مئوية أثناء معالجة الأنسجة. استخدم رؤوس الماصة ذات الفتحة الواسعة عند إجراء التخفيف التسلسلي باستخدام الأنسجة المتجانسة. جهز كتلة ال 96 بئرا الضخمة التي تحتوي على PBS مسبقا.