معالجة الأنسجة المصابة لتعداد البكتيريا في نموذج العدوى المشتركة للفئران

الملخص

المصدر: لينهارد، أ.، وآخرون. نموذج الفأر لانتقال المكورات الرئوية العقدية من مستعمرة إلى ممرض عند العدوى الفيروسية المشتركة يعيد المرض المتفاقم بسبب التقدم في العمر. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو معالجة رئتي فأر متصوب معا ببكتيريا ممرضة وفيروس. يسمح التقطيع، وتجانس، وتغطية نسيج الرئة بقياس كمية الحمل البكتيري، مما يشير إلى انتشار البكتيريا إلى الرئتين وشدة المرض.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. معالجة الأنسجة المصابة لتعداد البكتيريا

1. جمع الرئة
   1. باستخدام مقص التشريح، قم بقطع جانبي القفص الصدري المكشوف واسحب الأضلاع بلطف نحو رأس الفأر لكشف القلب. أدخل إبرة 25 جرام متصلة بحقنة 10 مل مملوءة مسبقا بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) في البطين الأيمن وابدأ الترويض ببطء. ابحث عن تبييض الرئتين كمؤشر على نجاح التروية. اغسل النسيج ببطء لتجنب كسر الأنسجة الرئوية.
   2. ارفع القلب بالملاقط وقم بعمل قطع لفصل الرئتين عن القلب. بعد الانفصال، التقط جميع فصوص الرئة بالملاقط واشطفها في طبق يحتوي على PBS معقم لإزالة أي دم متبق. في طبق بتري، اقطع الرئتين إلى قطع صغيرة وامزج جيدا. قم بإزالة نصف خليط الرئة لتحديد وحدات تكوين مستعمرة البكتيريا (CFU) أو وحدات تكوين اللويحات الفيروسية (PFU) وضعها في أنبوب دائري قاع بسعة 15 مل مملوء مسبقا ب 0.5 مل من PBS للتجانس.
      ملاحظة: من المهم عدم أخذ فحوصات مختلفة من نفس الرئة للتقييمات المختلفة. بدلا من ذلك، يجب تفريغ جميع الفحم، وخلطها معا بشكل جيد، وتجزئها بالتساوي في التقييمات المختلفة.
2. لتوحيد الأنسجة المجمعة، قم أولا بتنظيف مسبار التجانس بوضعه في 70٪ إيثانول وتشغيل المجسم عند طاقة 60٪ لمدة 30 ثانية. كرر الخطوة في ماء معقم لمدة 10 ثوان. قم بتجانس كل نسيج لمدة دقيقة واحدة. نظف مسبار التجانس في ماء معقم بين كل عينة وفي أنبوب جديد يحتوي على إيثانول بنسبة 70٪ بين كل عضو ومجموعة العينات.
3. تعداد أعداد البكتيريا
   1. بمجرد حصاد جميع الأعضاء وتجانسها، يتم تخفيف الألواح بشكل متسلسل على ألواح الأجار الدموية. لحساب إجمالي CFU، استخدم 10 ميكرولتر لتغطية ودون الحجم النهائي بالملليتر لكل عينة. حضن الحوض طوال الليل عند 37 درجة مئوية/5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقن BD ذات الاستخدام الواحد مع رؤوس Luer-Lok (1 مل)	فيشر	14-823-30
مقص التشريح الدقيق من فيشربراند	فيشر	08-951-5	الأدوات المستخدمة في الحصاد
ملقط فيشربراند لتشريح الأنسجة	فيشر	13-812-38	ملاقط للحصاد
محارب فيشربراند المعقمة للاستخدام الواحد (10 مل)	فيشر	14-955-459