توليد طبقة أحادية القولون البشرية ذات وظيفة حاجز لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

Abstract

المصدر: في ج. ج. وآخرون. طبقات أحادية القولون البشرية لدراسة التفاعلات بين مسببات الأمراض والسرطانات المشتركة وظهارة الأمعاء المضيفة. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو إجراء زراعة خلايا ظهارية مشتقة من القولون على نظام ترانسويل مغطى بالكولاجين لتوليد طبقة أحادية منتجة للمخاط تحاكي الحاجز المعوي وتمكن من إجراء دراسات تفاعل المضيف مع الممرض.

Protocol

1. تغطية التعليق المعوي/القولوني

1. إذا تم تخزين الإدخال المطلي عند 4 درجات مئوية، استقر في حاضنة زراعة أنسجة ب CO₂ بدرجة 37 °C/5٪ لمدة لا تقل عن 30 دقيقة قبل وضع الدرع الخلوي.
2. لكل إدخال سيتم طلعه، حضر 1 مل من وسط تمدد دافئ (بين 25-37 درجة مئوية) وأضف 10 ميكرومولار Y-27632 و10 ميكرومولار CHIR 99021.
   ملاحظة: يتكون EM من DMEM المتقدم (وسط النسر المعدل من دولبيكو) /F12 يحتوي على B27 (1x)، 50٪ وسط مكيف مع WNT3A، 15٪ وسط مكيف ب RSPO1، 10٪ وسط مكيف بنوجين، 50 نانوم/مل من عامل نمو البشرة البشري، 500 نانومتر A-83-01، 10 ميكرومولار SB 202190، كوكتيل مضاد حيوي/مضاد فطريات (1x)، 10 ملليمول هيبيس (N-(2-هيدروكسي إيثيل)بيبرازين-N'-(2-حمض الإيثانيسلفونيك))، ديببتيد L-ألانيل-إل-جلوتامين (1x)، وبنسلين-ستربتوميسين (1x) (انظر جدول المواد).
3. استنشق وسط الغسيل من الأنبوب الذي يحتوي على حبيبة الخلية وأعد تعليقه في حجم كهرومغناطيسي يكفي لإنتاج 100 ميكرولتر على الأقل لكل إدخال.
4. استنشق محلول الكولاجين الوريدي من كل إدخال واغسله مرتين ب 150 ميكرولتر من وسط الغسيل لكل إدخال.
5. نبت 600 ميكرولتر من كهرومغناطيسية في المساحة تحت كل إدخال.
6. مدمج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل إدخال.
7. أعد الطبق إلى حاضنة زراعة الأنسجة واتركه دون إزعاج لمدة لا تقل عن 12 ساعة.
   ملاحظة: تجنب هز أو إمالة اللوح بشكل حاد لمنع توزيع شظايا القولون بشكل غير متساو على الغشاء المدخل.
8. راقب التصاق الخلوي وانتشاره لتشكيل طبقة أحادية متلافقة عن طريق وضع اللوح على مجهر ضوئي متباين تحت عدسة موضوعية 2.5x-10x.
9. بعد يوم إلى يومين، يجب أن تلتصق معظم الشظايا بمصفوفة الكولاجين. جدد وسيط الزراعة وتوقف عن العلاج باستخدام Y-27632 وCHIR 99021. استمر في تجديد الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام حتى يلتقي به. عادة ما يتم الوصول إلى الالتقاء في 7-10 أيام.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-أمينو-2-(هيدروكسي ميثيل)-1,3-بروبانديول	سيغما	T4661	قاعدة تريس، مكون مخزن التحلل
A-83-01	توكريس	2939	مثبط ALK4/5/7
حمض الخليك، جليدي	فيشر ساينتيفك	A38
DMEM/F12 المتقدم	تقنيات الحياة	12634-010	مكون وسط النمو
مزيج المضاد الحيوي/مضاد الفطريات	إنفيفوجين	ANT-PM-2	بريموسين (100x)
B27، 50x	تقنيات الحياة	17504-044	مكون وسط النمو
إدخالات زراعة الخلايا	كورنينغ	3470	ترانسويل، غشاء PET، مسام 0.4 ميكرومتر، صفيحة 24 بئر
CHIR 99021	توكريس	4423	مثبط GSK3β
الكولاجين الرابع، من المشيمة البشرية	سيغما	C5533
محلول حصاد الأورجينويد كولتريكس	تريفيغن	3700-100-01	إزالة بلمرة مصفوفة الأغشية القاعدية
إيثانول، مطلق	فارمكو	111000200
جلوتاماكس	تقنيات الحياة	35050-061	ثنائي الببتايد L-ألانيل-L-جلوتامين، 200 ملليمولار
خط خلية HEK293T/نوجين-إف سي	مختبر فان دن برينك، معهد تيغات لأبحاث الكبد والأمعاء		لإنتاج وسط نوجين المعالج
خط خلايا HEK293T/RSPO1-Fc-HA	تريفيغن	3710-001-K	لإنتاج وسط مكيف ب Rspondin-1
هيبيس، 1 م	تقنيات الحياة	15630-080	مكون وسط النمو
عامل نمو البشرة البشرية (EGF)	أنظمة البحث والتطوير	236-EG-01M	مكون وسط النمو
مجهر ضوئي مقلوب لزراعة الخلايا	أوليمبوس	CKX51
خط الخلايا L-WNT3A	ATCC	CRL-2647	لإنتاج الوسيط المكيف Wnt3a
ماتريجيل، عامل نمو منخفض	كورنينغ	356231	مصفوفة الغشاء القاعدي للزراعة ثلاثية الأبعاد
مكشطة الخلايا الصغيرة	يونايتد بيوسسٹمز	MCS-200
الجسم المضاد MUC2، وحيد النسيلة للفأر	أبكام	AB11197	استخدمه عند 1:100 لتثبيت المناعة، و1:500 لتقليل المناعة
جسيمات الفيروس العدسي النسائي لشرب MUC2	جي إي دارماكون	RHS4531	shRNA فيروسي GIPZ العدسي، المعرف: 4583
هزاز المدار	جرانت إنسترومنتس	PSU-10i
البنسلين-ستربتومايسين، 100x	تقنيات الحياة	15140-122	مكون وسط النمو
جهاز السونيكاتر المجسوب مع ميكروتيب	برانسون ألتراسونيكس	450
كوكتيل مثبط البروتين لخلايا الثدييات	سيغما	P8340	مكون مخزن التحليل
SB 202190	توكريس	1264	مثبط MAPK p38
كلوريد الصوديوم	سيغما	S3014	مكون مخزن التحليل
ديكسويكولات الصوديوم	سيغما	D6750	مكون مخزن التحليل
كبريتات الصوديوم الدوديسيل	سيغما	L3771	مكون مخزن التحليل
TrypLE Express، 1x	تقنيات الحياة	12605-010	تريبسين، لهضم شظايا الأمعوية والقولون
الأجسام المضادة للفينكولين، وحيد النسيلة الأرنب	أبكام	ab129002	استخدم عند 1:1000 لفحص القطع المناعي
ماء، درجة زراعة الأنسجة، مصفى بشكل معقم	كورنينغ	25-055
Y-27632	توكريس	1254	مثبط RhoA/ROCK