توليد البلاستيدات النباتية من البكتيريا سالبة الجرام

الملخص

المصدر: فيغيروا، د. وآخرون. إنتاج وتصوير البلاستات البكتيرية والبروتوبلاستات لتوصيف مواقع الببتيدات المضادة للميكروبات. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تحضير البلاستيدات السميكة من بكتيريا سالبة الغرام على شكل قضيب. تنمو البكتيريا بوجود مضاد حيوي لتكوين خيوط ممدودة. يتم غسل هذه القطع بمحلول مفرط التوتر ومعالجة بمحلول تحلل لإزالة الجدار الخارجي للخلية. يشكل المعالجة منخفضة التوتر الكرويات الصلبة، التي تثبت بمحلول إيزوتوتر مبرد وتخزن في ظروف باردة.

البروتوكول

1. تحضير المحلول

ملاحظة: جهز المحاليل الموصوفة في الخطوات 1.1–1.9 لإنتاج أسطورة إسكيريشيا قولونية (E. coli) من الطبقات الكروية

1. جهز 1 مليون تريس (هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان هيدروكلوريد (Tris-Cl)، بدرجة حموضة 7.8 عن طريق إذابة 10.34 جرام من تريس·HCl و4.17 جرام من تريس(هيدروكسي ميثيل)أمينوميثان (Tris·OH) في 50 مل من الماء المقطر (dH₂O) في قارورة بحجم 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.
2. تحضير محلول A (كلوريد مغنيسيوم 20 ملليمول (MgCl₂)، 0.7 ملليستر سكروز، 10 ملليمولار تريس-كل، pH 7.8) عن طريق إذابة 0.10 جرام ملغيوم كليل₂ (95.2 ج/مول) و11.98 جرام سكروز (342.3 جم/مول) في 25 مل dH₂O في قارورة بسعة 125 مل. أضف 500 ميكرولتر 1 متر Tris-Cl (رقم الهيدروجيني 7.8) واضبط الحجم إلى 50 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير المحلول B (10 ملليموتر MgCl₂، 0.8 ملليستر سكروز، 10 ملليموتر تريس-كليل، pH 7.8) عن طريق إذابة 0.05 جرام MgCl₂ (95.2 جم/مول) و13.69 جرام سكروز (342.3 جم/مول) في 25 مل dH₂O في قارورة بسعة 125 مل. أضف 500 ميكرولتر 1 متر Tris-Cl (رقم الهيدروجيني 7.8) واضبط الحجم إلى 50 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.
4. جهز 0.8 مليون سكروز عن طريق إذابة 13.69 جرام سكروز (342.3 جم/مول) في 50 مل dH₂o في قارورة بسعة 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.
5. جهز 5 ملغ/مل من ديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I) عن طريق إذابة 0.015 جرام DNase I في 3 مل من dH₂o في قارورة 50 مل. التعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بقطر 25 مم مع غشاء بحجم 0.2 ميكرومتر. محلول Aliquot في أنابيب الميكروفوج وتخزينه عند −20 درجة مئوية.
6. تحضير 0.125 مولار إيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA)، بدرجة حموضة 8.0، عن طريق إذابة 0.698 جرام من ثنائي الصوديوم EDTA (372.2 جم/مول) إلى 15 مل dH₂o في قارورة بسعة 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.
7. جهز 600 ميكروغرام/مل سيفاليكسين عن طريق إذابة 0.03 جرام من هيدرات السيفاليكسين (365.404 جم/مول) في 50 مل من dH₂o في قارورة بسعة 125 مل. التعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بقطر 25 مم مع غشاء بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
8. جهز 5 ملغ/مل ليزوزيم عن طريق إذابة 0.015 جرام ليزوزيم في 3 مل من dH₂O في قارورة بسعة 50 مل. التعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بقطر 25 مم مع غشاء بحجم 0.2 ميكرومتر. محلول Aliquot في أنابيب الميكروفوج وتخزينه عند −20 درجة مئوية.
9. حضر 3٪ بدون جرعة من مرق الصويا (TSB) عن طريق إذابة 30 جرام من TSB في 1 لتر من dH₂O في قارورة بسعة 2 لتر. يتم تضمين المحلول في قوارير تحتوي على 25 مل أو 100 مل TSB لاستخدامها في تحضير الأريشية الكروية الإشريكية القولونية أو بروتوبلاستيدات B. megaterium على التوالي. قوارير الأوتوكلاف لتعقيم الوسط السائل. يمكن تخزين TSB المعقم إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
10. تحضير المحلول C (1 M السكروز، 0.04 M ماليات، 0.04 M MgCl₂، pH 6.5) عن طريق إذابة 34.23 جرام سكروز (342.3 جم/مول)، 0.46 جرام حمض الماليك (116.07 جم/مول)، و0.38 جرام MgCl₂ (95.21 جم/مول) في 100 مل من dH₂o في قارورة بسعة 250 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح عبر فلتر حقنة بحجم 25 مم مع غشية بحجم 0.2 ميكرومتر وتخزينها في أنبوب مخروطي عند درجة حرارة الغرفة.

2. تحضير الثقافة الليلية

ملاحظة: قم بأداء الأقسام 2-3 باستخدام تقنيات التعقيم المناسبة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أن تحتوي السلالة البكتيرية على بلازميد لمقاومة المضادات الحيوية لتقليل التلوث المحتمل. إذا كنت تستخدم سلالة تحمل مقاومة للمضادات الحيوية، أضف المضادات الحيوية اللازمة في الخطوات 2.1 و3.1–3.2.

1. جهز مزرعة ليلية عن طريق اختيار مستعمرة واحدة من البكتيريا باستخدام طرف ماصة معقمة ووضعها في أنبوب زراعة بسعة 14 مل يحتوي على 2–3 مل من 3٪ مع TSB. الحضانة عند 37 درجة مئوية، مع الاهتزاز لمدة 16–21 ساعة.

3. تحضير الأريشية القولونية سالبة الجرام

1. في قارورة بسعة 250 مل، قم بتخفيف الزراعة الليلية بنسبة 1:100 في حجم 25 مل بنسبة 3٪ مع الجهد TSB وحضن المحلول البكتيري عند 37 درجة مئوية، مع هز المحلول لمدة تقارب 2.5 ساعة حتى يصل المحلول إلى كثافة بصرية بين 0.5–0.8 عند 600 نانومتر. قس الكثافة البصرية باستخدام مقياس طيفي.
2. في قارورة بسعة 250 مل، يتم تخفيف هذه الزراعة بنسبة 1:10 في 30 مل بنسبة 3٪ مع 3٪ من الجهد TSB وتحتضن عند 37 درجة مئوية، مع هز لمدة 2.5 ساعة في وجود 60 ميكروغرام/ملتر سيفاليكسين (347.4 جم/مول) لإنتاج خيوط خلية واحدة بطول حوالي 50–150 ميكرومتر، يمكن ملاحظتها تحت تكبير 1000x باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 1B).
3. احصد الخيوط عن طريق طرد المحلول البكتيري بقوة 1,500 × جرام، 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق. قم بإفراغ وتخلص من السوبرناتانت، مع الاحتفاظ بالحبيبة.
4. اغسل الخيوط بإضافة 1 مل من السكروز 0.8 متر، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. حضن القرص لمدة دقيقة واحدة، ثم تخلص من الفائق دون إزعاج الحبيبة.
5. أضف 150 ميكرولتر من 1 M Tris-Cl (pH 7.8)، و120 ميكرولتر من 5 ملغ/ملليتر ليزوزايم، و30 ميكرولتر من 5 ملغ/ملليتر DNase I، و120 ميكرولتر من 0.125 ملليتار EDTA بترتيبها الخاص إلى الحبيبة، وحضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
6. أضف 1 مل من محلول A تدريجيا خلال دقيقة واحدة إلى المحلول المعد في 3.5 باستخدام ميكروبايبت مع تدوير المحلول بلطف يدويا. حضن المحلول لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. ضع 7 مل من محلول B بدرجة 4 °C في أنبوبين مخروطيين بحجم 15 مل. أضف كميات متساوية من المحلول المحضر في 3.6 لكل من هذين الأنبوبين. قم بطرد المركزي بالمحلول عند 1,500 × g، و4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق.
8. باستخدام ماصة مصلية، قم بإزالة كل كمية السوبريتانت ما عدا 1-2 مل بحذر دون إزعاج الحبيبة. أعد تعليق الحبيبة عن طريق الرش بلطف للأعلى والأسفل باستخدام ميكروبيبت P1000. تحقق بصريا من تكوين الكروات الكروية من خلال ملاحظة العينة بتكبير 1000x باستخدام مجهر ضوئي (الشكل 1C).
9. تخزين الطبقات الكروية على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع أو حتى تمر بثلاث دورات تجمد وإذابة.

النتائج

الشكل 1: صور تمثيلية لبكتيريا الإشريكية القولونية. (A) بكتيريا الإشريكية القولونية ، (B) ثعبان E. coli ، و(C) E . coli spheroplast. تم التقاط الصور بتكبير 100 مرة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
تريزما هيدروكلوريد (تريس HCl)	سيغما	T3253
قاعدة تريزما (تريس أوهايو)	سيغما	T1503
كلوريد المغنيسيوم	سيغما	M8266
سكروز	سيغما	S7903
ليسوزيم	سيغما	L6876
ديوكسي ريبونوكلياز I	سيغما	D4527
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك	سيغما	106361	استخدم 106361 سيغما في تطوير البروتوكول الأصلي؛ 106361 تم إيقافه مع ED2SS كبديل
سيفاليكسين هيدرات	سيغما	C4895
مرق الصويا BBL Trypticase	فيشر ساينتيفك	B11768
حمض الماليك	سيغما	M0375
فلتر حقنة Acrodisc 25 مم مع غشاء Tuffryn HT بحجم 0.2 ميكرومتر	شركة بال	4192