تأسيس نموذج فأر لعدوى المكورات العقدية في المجموعة ب المهبلية

الملخص

المصدر: باتراس، ك. أ.، دوران، ك. س. نموذج فأر لاستعمار المكورات العقدية من المجموعة ب. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو تحضير وتلقيح فأر أنثى عولجت بالهرمونات مصابة بالمكورات العقدية من المجموعة B لنمذجة العدوى. يشرح كيفية زراعة وتحضير البكتيريا، وإعطاء اللقاح في التجويف المهبلي، وضمان نجاح العدوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. التلقيح المهبلي بالمكورات العقدية من المجموعة ب (GBS)

1. قبل يوم واحد من التطعيم، ازرع مزرعة سائلة بحجم 5 مل طوال الليل لسلالة GBS محل اهتمام، مثل A909 (النمط المصلي Ia)، في مرق تود هيويت (THB) عند 37 درجة مئوية.
2. زراعة البكتيريا في الحوض خلال الليل عند حجم 1:10 إلى THB طازج وحضانة عند 37 درجة مئوية. ننمو البكتيريا إلى مرحلة منتصف اللوغاريوم (OD₆₀₀ = 0.4-0.5).

ملاحظة: عادة ما يستغرق هذا من ساعتين إلى ثلاث ساعات، حسب نوع GBS.

3. انقل الزراعة الفرعية إلى أنبوب مخروطي معقم بحجم 15 مل وبكتيريا حبيبات بوزن 3000 × جرام لمدة 5 دقائق. استنشق السوبرناتان. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 200 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
4. باستخدام الحبيبة المعلقة، قم بنقل 3 - 5 مل من PBS (1 مل لكل 10 فئران) إلى OD₆₀₀ = 0.4 بالضبط في أنبوب زراعة جديد بحجم 5 مل. سيكون تركيزا من ~ 1 × 10^وحدات تشكيل مستعمرات (CFU)/مل. انقله إلى أنبوب مخروطي جديد بحجم 15 مل وأعد طرد البكتيريا بحرارة 3000 × جرام لمدة 5 دقائق. استنشق السوبرناتان.
5. أعد تعليق الحبيبة في PBS عند 1/10 الحجم الأصلي. على سبيل المثال، إذا تم دفع 3 مل من OD₆₀₀ = 0.4 بالتلوين، فأعد تعليقها في 300 ميكرولتر من PBS.

ملاحظة: هذا هو التعليق البكتيري النهائي (~ 1 × 10⁹ CFU/ml) المستخدم في تلقيح الحيوانات.

6. احتفظ ب 50 ميكرولتر من هذا التعليق للتخفيف المتسلسل والطلاء على الأجار THB لتحديد اللقاح الدقيق.
7. قم بتطعيم كل فأر ب 10 ميكرولتر من التعليق البكتيري النهائي بحيث يتم إعطاء 1 ×^{10 7} وحدة تحكم بكتيري لكل فأر.
   1. للتلقيح، يتم تقييد الفأر يدويا عن طريق تثبيت الجلد الفضفاض عند مؤخرة الرقبة بين إبهام المعالج وسبابته ثم تثبيت الذيل.
   2. اسحب 10 ميكرولتر من GBS في رأس ماصة تحميل هلام بسعة 200 ميكرولتر. أدخلي الطرف من 5 إلى 10 مم في التجويف المهبلي ووزعي 10 ميكرولتر من اللقاح.
      ملاحظة: تفضل رؤوس التحميل الهلامي على رؤوس 200 ميكرولتر القياسية لتقليل خطر إصابة أو إصابات في الأعضاء، خاصة في الفئران الأصغر أو الصغيرة.
   3. مباشرة بعد التطعيم، أطلق مؤخرة الرقبة وارفع الطرف الخلفي للفأر، ثم رفع الفأر من الذيل وامش كفوفه الأمامية على سطح صلب لمدة ~ دقيقة واحدة.
   4. افحص فتحة المهبل بصريا بحثا عن أي تدفق عكسي للتلقيح. إذا لوحظ تدفق عكسي، قد يستخدم رأس ماصة جديد للتلاعب أو توسيع فتحة المهبل، مما يسهل امتصاص التدفق العكسي إلى التلومين. بالإضافة إلى ذلك، يمكن سحب التدفق العكسي عبر ماصة وإعادة تلقيحه.
      ملاحظة: إذا تم إعطاء عوامل موضعية أو كائنات بروبيوتية أو بروتينات ذات اهتمام، قد يعطى حجم يصل إلى 20 ميكرولتر في حاجز فسيولوجي في الجهاز المهبلي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
رؤوس ماصة تحميل جل بحجم 200 ميكرولتر	يو إس إيه ساينتيفك	1252-0610
مرق تود هيويت	هاردي ديسجنوستيكس	7161C
محلول الملح المخزن بالفوسفات من دولبيكو 1x	كورنينغ	21-031-CV