يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
312 مشاهدة
⸱
فبراير 26, 2026
المصدر: تاي، س. ب.، et.al. الاضطراب المضاد للفيروس للأغشية الحيوية الممرضة باستخدام اللاكتوناز الهندسي لتبريد النصاب الطبيعي. J. Vis. Exp. (2016)
يوضح هذا الفيديو عملية تثبيط تكوين الغشاء الحيوي من خلال إدخال إنزيم يعطل إشارات الخلايا البكتيرية. يمنع الإنزيم البكتيريا من إنتاج مواد بوليمرية خارج الخلية، مما يقلل من تطور الأغشية الحيوية على طبق صغير ذو قاع زجاجي. وأخيرا، يتم تصور بنية الغشاء الحيوي باستخدام الليكتينات الفلورية والمجهر الماسح بالليزر الكونفوكلي.
1. المجهر الماسح بالليزر الكونفوكال لفيلم A . baumannii S1 Biofilm
1. زراعة مزرعة بحجم 5 مل من A. baumannii S1 في الحوض عند درجة حرارة 30 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (220 دورة في الدقيقة) لمدة 16 ساعة.
2. تعديل زراعة A. baumannii S1 إلى مقدار OD600 المطلوب بقيمة 0.8. باستخدام طبق μ ذو قاع زجاجي بقطر 35 مم، قم بتلقيح مزرعة البكتيريا (تخفيف بنسبة 1:100) في LB طازج يحتوي على 30 ميكرولتر من إنزيم GKL المنقى (40 ملغ/مل); المجلد النهائي من الثقافة الجديدة هو 1 مل.
3. غط الطبق μ بغطاء وضعه في حاوية بلاستيكية محكمة الإغلاق بسعة 10 لتر. حضن الطبق μ على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعات قبل إزالة الوسط بلطف. أضف 30 ميكرولتر من إنزيم GKL المنقى ووسط طازج، ليصل إلى حجم إجمالي 1 مل. حضن لمدة 21 ساعة أخرى عند 30 درجة مئوية.
4. كرر الخطوة 1.3 وحضن طبق μ لمدة 24 ساعة أخرى عند 30 درجة مئوية. ثم أزل الوسائط بلطف.
5. أضف 500 ميكرولتر من أغلوتينين جرثوم القمح المترافق أليكس فلو 488 (WGA) المذائب في محلول الملح المتوازن (HBSS) إلى الطبق وحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ هذا سيصبغ الغشية الحيوية المتشكلة. أزل محلول التلوين واغسل طبق μ ب 2 مل من HBSS. كرر خطوة الغسل مرة أخرى.
6. أضف 500 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 3.7٪ مذاب في HBSS وحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة؛ هذا سيثبت الفيلم الحيوي على μ-Dish. اغسل الطبق مرة واحدة ب 2 مل من HBSS ثم أزل المحلول تماما. يمكن تخزين الطبق μ المثبت بطبقة حيوية في الظلام عند 4 درجات مئوية قبل تصوير CLSM.
7. لتصوير وتحليل CLSM، استخدم تكبير 63 مرة لتوليد 97 تكدسة لكل صورة بفاصل 0.21 ميكرومتر لكل مجموعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| التريبتون | BD | 211705 | |
| مستخلص الخميرة | BD | 212750 | |
| صفيحة ذات 96 بئر | Costar | 3596 | |
| حمض الخليك | الفحص المختبري | PLA00654X | تحذير: قابل للاشتعال |
| μ-الطبق | إيبيدي | 80136 | |
| أليكس فلو 488 رابطة نقابة مرافق | إنفيتروجين | W11261 | |
| محلول الملح المتوازن لهانك | إنفيتروجين | 141475095 | |
| الفورمالديهايد | سيغما-ألدرتش | F8775 | تحذير: تآكل |
| قارئ اللوحة الدقيقة Synergy HT | BioTek | ||
| مجهر الفلورة المقلوب 1X-81 | أوليمبوس |
