اكتشاف السكريات في الزراعة الثنائية باستخدام تفاعل متسلسل بوليميراز

الملخص

المصدر: كولينز، أ. ج. وآخرون، تأسيس الزراعة الثنائية المستقرة للسكاريا التعايشية من تجويف الفم. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن البكتيريا السكرية في مزرعة ثنائية باستخدام أكتينومايسيس. يوضح البروتوكول تضخيم الحمض النووي والرحلان الكهربائي الهلام لتأكيد تفاعل مستقر بين المضيف والطفيلي.

البروتوكول

1. تأكيد عدوى السكري بالكتريا بواسطة PCR
   1. بعد 5 مرات، تأكد من العدوى بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ستضمن خمسة مقاطع أن أي خلايا ساكارباكتيريا غير نامية قد استنزفت إلى ما بعد حد الكشف باستخدام 25 دورة من PCR.
   2. حضر خليط PCR رئيسي. الوصفة المقترحة هي كالتالي: لكل أنبوب مطلوب، حضر 12.5 ميكرولتر 2x PCR خازن، 0.75 ميكرولتر 10 ميكرومولار برايمر أمامي (580F¹² - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C)، 0.75 ميكرولتر 10 ميكرومولار برايمر عكسي (1177R¹³- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT TCC)، 1 ميكرولتر 25 ملليموتر MgCl_{2, و9} ميكرولتر ماء. امزج عن طريق الدوامة.
   3. أليكوت 24 ميكرولتر من الخليط الرئيسي داخل أنبوب PCR بسعة 0.2 مل. أضف 1 ميكرولتر من الزراعة المصابة بالسكري إلى تفاعل PCR. ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري ونفذ البروتوكول التالي: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، 25 دورة بدرجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، الإطالة النهائية عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين، ثم التثبيت النهائي عند 4 درجات مئوية.
   4. قم بتحميل وتشغيل منتجات PCR في جل أغاروز بنسبة 1٪. شريط من ~600 قاعدة يشير إلى وجود الساكاريبكتيريا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغاروز	فيشر ساينتيفك	BP160-100
مرق حقن القلب (مسحوق مجفف)	بيكتون-ديكنسون	211059	أو وسائط نمو أخرى مناسبة للكائنات المستهدفة
مصدر طاقة الرحلان الكهربائي	بيو-راد	1645052
جهاز الرحلان الكهربائي	بيو-راد	1704467
جوتاك جرين ماسترميكس	بروميغا	M7122
ماسترسايكلر برو ثيرموسايكلر	إبندورف	950040025	أو دورة حرارية مكافئة لجهاز PCR
محلول MgCl₂ 25 ملمو مولار	بروميغا	A3513
مياه بدرجة علم الأحياء الجزيئي	فيشر ساينتيفك	BP2819100
الماصة الدقيقة P-1000	جيلسون	F123601G
أنابيب PCR بحجم 0.2 مل	فيشر ساينتيفك	14-230-205
أطراف الماصبة - 1000 ميكرولتر	فيشر ساينتيفك	02-717-166
صبغة جل الحمض النووي الآمن SYBR	ثيرموفيشر ساينتيفيك	S33102
مرق الصويا التربتيكي (مسحوق مجفف)	بيكتون-ديكنسون	211825	أو وسائط نمو أخرى مناسبة للكائنات المستهدفة