$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: خلال التجربة بأكملها، يتم حضن خلايا البلاعم عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة هواءمجبر بتركيز ثاني أكسيد الكربون 5٪ وتخرج من الحاضنة فقط للتلاعب التجريبي، والتي تجرى في خزانة أمان بيولوجي من الفئة الثانية. العمل مع بكتيريا ليستريا مونوسيتوجينس يتوافق مع لوائح السلامة البيولوجية المستوى 2.
1. تحضير الخلايا والعدوى البكتيرية (اليومين 1 و2)
- اليوم الأول
- بذور 2.0 ×10 خلايا بلعمية مشتقة من نخاع العظم (BMDM) على طبق بحجم 145 مم في وسط BMDM + Pen-Strep بحجم 30 مل (الجدول 2). تم تحليل 3 أطباق لكل سلالة بكتيرية. حضن الغرفة طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة هواء قسري بتركيز ثاني أكسيد الكربون5 ٪.
- ابدأ زراعة بكتيرية ليلية لسلالة L. monocytogenes البرية 10403S في 10 مل من وسط تسريب القلب في الدماغ (BHI)، عند 30 درجة مئوية في حاضنة قياسية. ضع أنابيب الزراعة مائلة دون هز.
ملاحظة: هذه الظروف النامية ترفع من تعبير جينات السواط، مما يعزز العدوى الفعالة.
- اليوم الثاني
- متوسط BMDM قبل التسخين (بدون مضادات حيوية Pen-Strep) (الجدول 2) ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند 37 درجة مئوية.
- اغسل طبقة البلاعم أحادية الطبقة مرتين مع 25 مل من PBS المسخن مسبقا لإزالة المضادات الحيوية. أضف 30 مل من BMDM متوسط الطازج.
- اغسل 1.5 مل من الزراعة البكتيرية الليلية باستخدام PBS عن طريق طرد البكتيريا بمقدار > 14,000 x g لمدة دقيقة واحدة، مع التخلص من السوبرناتانت، وإعادة تعليق البكتيريا بلطف في 1.5 مل من PBS عن طريق التنبيه. كرر ذلك مرتين.
- قم بإصابة كل لوحة بلاعمية ب 0.5 مل من مزرعة مغسولة طوال الليل من النوع البري L. monocytogenes. إذا كنت تستخدم عدة أطباق، قم بإصابة كل لوح بفارق 15 دقيقة. سيمكن هذا الفاصل الزمني من حصاد كل طبق بشكل فردي في نهاية العدوى.
ملاحظة: يتم قياس تعدد العدوى (MOI) عن طريق تغليف التخفيفات المتسلسلة لزراعة البكتيريا المستخدمة في العدوى على صفائح الأجار BHI وعد وحدات تكوين المستعمرات (CFU) بعد حضانة 24 ساعة للصفائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. استخدام 0.5 مل من سلالة WT L. monocytogenes 10403S ينتج عن MOI ~ 100 (100 وحدة CFU بكتيريا لكل خلية بلعمية). عند تحليل الطفرات البكتيرية المعيبة في النمو داخل الخلايا، يجب النظر إلى ارتفاع مؤشر التأثير الداخلي. - بعد حضانة لمدة 0.5 ساعة عند 37 درجة مئوية، اغسل الخلايا المصابة مرتين ب PBS لإزالة البكتيريا غير المتصلة، وأضف 30 مل من وسط BMDM المسخن مسبقا. البكتيريا الملتصقة ستستوعب خلال الساعة النصف القادمة.
- بعد ساعة من العدوى، أضف 30 ميكرولتر من الجنتاميسين (1:1,000 للوصول إلى تركيز نهائي 50 ميكروغرام/مل) لقتل البكتيريا خارج الخلية.
- قم بتجميع جهاز الفلتر عن طريق وضع رأس فلتر على قارورة سائل جمع مع منفذ تفريغ كهربائي. ثم ضع فلتر (0.45 ميكرومتر) على رأس الفلتر، يليه قمع أسطوانة، وتثبيت الأجزاء المختلفة بمشبك معدني. حضر ماء بارد كالثلج خال من RNase.
- بعد 6 ساعات من العدوى، اجمع البكتيريا من الخلايا المصابة كما يلي. تعامل مع كل طبق بشكل منفصل.
ملاحظة: عادة ما يكمل L. monocytogenes 1-log من النمو خلال 6 ساعات من العدوى في خلايا البلاعمية. قد تؤدي الحضانات الأطول إلى فرط نمو البكتيريا وموت الخلايا في الخلايا البلعمية، بينما قد تؤدي فترات الحضانة الأقصر إلى تقليل الأحمال البكتيرية بشكل كبير. يمكن تعديل MOI ووقت العدوى للوصول إلى أفضل الظروف.- اغسل الخلايا المصابة ب PBS مرة واحدة. أضف 20 مل من الماء البارد الخالي من RNase لتحليل الخلايا البلعمية. باستخدام مكشطة الخلايا، قم بكشط الخلايا من اللوحة بسرعة ولكن بحذر.
- اجمع الخلايا المتحللة في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. دوامة لمدة 30 ثانية. الطرد المركزي عند 800 × g لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- مرر المادة الفائقة عبر جهاز المرشح باستخدام نظام تفريغ. باستخدام الملقط، قم بلف الفلتر وانقله بسرعة إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. قم بتجميد الأنابيب مع الفلاتر في النيتروجين السائل.
- قم بتجميع جهاز الترشيح باستخدام مرشح جديد للعينة التالية، كما هو موضح في 1.2.7.
- خزن الفلاتر المجمدة عند -80 درجة مئوية لليوم التالي. بدلا من ذلك، انتقل مباشرة إلى استخراج الأحماض النووية.
الجدول 1: بروتوكول تفاعل DNase.
| RNA | حتى 2 ميكروغرام (بأقصى حجم 44 ميكرولتر) |
| مخزن DNase 10x | 5 ميكرولتر |
| مياه خالية من RNase | مكتمل حتى 50 ميكرولتر إجمالي الحجم |
| الحمض النووي | 1 ميكرولتر (وحدة واحدة) |
الجدول 2: وصفات الوسائط والمخازن.
| 1. 500 مل BMDM+قلم الوصلة العقدية (معقم بالفلتر): | |
| دولبيكو الوسيط المعدل (DMEM) | 235 مل |
| مصل البقر الجنيني (FBS) (تم تعطيل الفيروس لمدة 30 دقيقة عند 54 درجة مئوية) | 100 مل |
| عامل تحفيز مستعمرة البلاعم أو M-CSF (وسط مشروط L-929) | 150 مل |
| الجلوتامين | 5 مل |
| بيروفات الصوديوم | 5 مل |
| β-ميركابتوإيثانول | 0.5 مل |
| البنسلين/الستربتوميسين | 5 مل |
| المجموع | 500 مل |
| 2. 500 مل BMDM (معقم بالفلتر): | |
| DMEM | 235 مل |
| FBS (تم إيقافه لمدة 30 دقيقة عند 54 درجة مئوية) | 100 مل |
| M-CSF (وسط مكيف L-929) | 150 مل |
| الجلوتامين | 5 مل |
| بيروفات الصوديوم | 5 مل |
| β-ميركابتوإيثانول | 0.5 مل |
| المجموع | 500 مل |
| 3. مخزن AE | |
| أسيتات الصوديوم (NaOAc) pH 5.2 | 50 مللي موتر |
| حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) | 10 مللي مولار |
| مياه خالية من RNase | |
| 4. الفينول-كلوروفورم-IAA | |
| الفينول | 25 مل |
| الكلوروفورم | 24 مل |
| كحول الأيزو-أميل | 1 مل |
| 5. الكلوروفورم-IAA | |
| الكلوروفورم | 24 مل |
| كحول الأيزو-أميل | 1 مل |