استخراج الحمض النووي الريبي من ليستريا مونوسيتوجينات المستخرجة من بلاعم الفأر المصابة

الملخص

المصدر: سيغال، ن.، وآخرون. تنقية الحمض النووي الريبي من الليستيريا مونوسيتوجينات المزروعة داخل الخلايا في خلايا البلاعمية. J. Vis. Exp. (2016)

يظهر هذا الفيديو استخراج الحمض النووي الريبي من ليستريا مونوسيتوجينات معزولة من بلاعم الفأر المصابة. يحافظ البروتوكول على الحمض النووي الريبي، ويحلل الخلايا باستخدام الفينول-كلوروفورم والحرارة، ويفصل الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي. الملح والإيثانول، مع الحضانة الباردة، يشجعان على ترسيب الحمض النووي الريبي. يلتقط الحمض النووي الريبي الناتج التعبير الجيني الناتج عن المضيف، كاشفا عن ضراوة البكتيريا واستراتيجيات التكيف.

البروتوكول

1. استخراج الأحماض النووية

ملاحظة: قم بجميع عمليات التلاعب باستخدام محاليل الفينول والكلوروفورم في غطاء بخار.

1. حضر خليطا بنسبة 1:1 من الفينول المحمض: الكلوروفورم، 400 ميكرولتر لكل عينة. اخلط في أنابيب منفصلة، ثم سحب الطبقة المائية الناتجة عن طريق الشفط. أضف 40 ميكرولتر من 10٪ SDS.
2. قم بإذابة الأنابيب التي تحتوي على فلتر على الثلج للحفاظ على برودتها. أضف إلى كل أنبوب يحتوي على مرشح 650 ميكرولتر من مخزن الأسيتات-EDTA (AE) (50 ملليمولار NaOAc pH 5.2، 10 ملليمول EDTA، ماء خال من RNase).
3. قم بتنفيذ الخطوات التالية بأسرع وقت ممكن.
   1. قم بتدوير الأنبوب الذي يحتوي على الفلتر بقوة بحيث يخفق الفلتر إلى طرف الأنبوب ويغسل المخزن الفلتر بالكامل. دائما حافظ على برودة الأنبوب بوضعه مرة أخرى على الثلج.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري أيضا تدوير الأنبوب أثناء انعكاسه لغسل البكتيريا تماما عن الفلتر.
   2. كرر ذلك لجميع الأنابيب. قد يكون من المفيد تدوير نظام التعليق لفترة قصيرة (دقيقة واحدة عند 120 × g) في نهاية العملية.
4. انقل المخزن اليحتوي على البكتيريا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على خليط SDS والفينول/الكلوروفورم. كرر ذلك لجميع الأنابيب. قد يكون من الضروري تدوير الفلتر الذي يحتوي على أنابيب (دقيقة واحدة عند 120 × g) مرة أخرى للحصول على المخزن المتبقي من الفلتر.
5. ضع جميع أنابيب 1.5 مل في جهاز دوامة متعدد الأنابيب، والدوامة بسرعة كاملة لمدة 10 دقائق.
6. حضن الأنابيب في كتلة حرارية بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. الطرد المركزي عند أقصى سرعة (> 14,000 × g) لمدة 5 دقائق.
7. انقل الطبقة المائية (حوالي 400 ميكرولتر) من كل أنبوب إلى أنبوب جديد بحجم 1.5 مل يحتوي على 40 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم 3 مولار (pH 5.2) و1.0 مل من الإيثانول 100٪. قم بعمل دوامة لكل أنبوب بشكل جيد.
   ملاحظة: يمكن إضافة الجليكوجين في هذه المرحلة لتحسين رؤية الحبيبات المتراكبة.
8. حضن العينات عند -80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. بدلا من ذلك، حضن العينات عند -20 درجة مئوية خلال الليل. ثم قم بالطرد المركزي للعينات عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة عند أقصى سرعة (> 14,000 × g).
9. قم بسحب الإيثانول (الطبقة العلوية) بعناية من كل أنبوب. أضف 500 ميكرولتر إيثانول بارد بنسبة 70٪ لكل عينة وابدأ الدوران جيدا. الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة عند أقصى سرعة (> 14000 × g).
10. استنشق الإيثانول بحذر من كل أنبوب. جفف العينات لمدة حوالي دقيقتين باستخدام مبخر فراغ بدون حرارة. لا تجف العينات أكثر من اللازم.
11. أضف 25 ميكرولتر ماء خال من RNase إلى كل عينة. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. دوامة ودوران بحذر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ليستريا مونوسيتوجينيس 10403S
H2O، خال من RNAse	ثيرمو ساينتفيك	10977-015	يمكن استخدام المياه المعالجة ب DEPC
درجة حموضة مشبعة بالفينول 4.3	فيشر	BP1751I-400
الكلوروفورم	فيشر	BP1145-1
كحول الأيزو-أميل	سيغما-ألدرتش	W205702
أسيتات الصوديوم	سيغما-ألدرتش	W302406
EDTA	سيغما-ألدرتش	EDS
SDS 10٪	سيغما-ألدرتش	L4522
الإيثانول المطلق	ميرك ميليبور	1070174000
مرشحات MF-Millipore بأبعاد 45 مم، 0.45 ميكرومتر	ميرك ميليبور	HAWP04700
فورتكس-جيني 2	الصناعات العلمية	الطراز G560E
كتلة تدفئة 65 درجة مئوية	ثيرمو ساينتفيك
جهاز طرد مركزي على طاولة 4 °م	إبندورف	5417R
الماصات المعقمة، 25 مل	غرينر
أنابيب فالكون، 50 مل	غرينر
أنابيب بحجم 1.7 مل، خالية من RNase	أكسجين	MCT-175-C
نظام سبيد فاك	ثيرمو ساينتفيك	SPD131DDA