$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
1. تحضير اللقاح البكتيري الممرض لفيروس الإشريكية القولونية (UPEC)
- جهز اللقاح لالتهابات المسالك البولية 89 (UTI89) (ابدأ قبل 72 ساعة من يوم التطعيم)
- سلسلة من UTI89 على طبق أجار LB (لوريا-بيرتاني) من مخزن مجمد. حضن الحوض طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية. اختر مستعمرة وقم بتطعينه بمقدار 10 مل من الرقعة في قارورة بسعة 125 مل. حضانة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بشكل ثابت.
- قم بتطعيم 10 ميكرولتر من الزراعة الليلية في 10 مل من LB في قارورة جديدة بسعة 125 مل لمدة 24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، بشكل ثابت.
- نقل 3 مل (سيختلف حسب الإجهاد وحجم اللقاح المطلوب) إلى أنابيب معقمة بحجم 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بقوة 7000 x جرام لمدة 3 دقائق، ثم أعد تعليق الحبيبة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وجهاز طرد مركزي مرة ثانية. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل 1x PBS.
- قس الكثافة البصرية للبكتيريا واضبط التركيز إلى كثافة اللقاح المطلوبة. التركيز القياسي لللقاح المستخدم هو 107 بكتيريا؛ ومع ذلك، قد يختلف هذا بسبب تصميم الدراسة.
2. التطعيم بالبكتيريا
- نظف محطة العمل بنسبة 70٪ إيثانول وغط المنطقة بورق ماص (أو استخدم غطاء تدفق معقم).
- اسحب حتى 0.9 مل من اللقاح البكتيري المحضر إلى حقنة 1 مل من توبركولين (TB) (إزالة فقاعات الهواء). قم بتثبيت إبرة تلقيح معقمة محضرة باستخدام البولي إيثيلين بحجم 10 (PE10) أنبوب على الحقنة التي تحتوي على التلقيح، ثم قم بقص أنبوب البولي إيثيلين بشكل معقم.
ملاحظة: اترك 1 مم من الأنبوب فوق طرف الإبرة لتجنب ثقب المثانة. - اقطع قطعة مربعة من البارافيلم بحجم بوصة واحدة وضع طبقة من مادة التشحيم الجراحية (بحجم عشرة سنتات تقريبا) فوقها.
- قم بتخدير أنثى فئران C3H/HeN بوضعها في غرفة تبخير (وفقا لبروتوكول المصنع) حتى تفقد وعيها لكنها لا تزال تتنفس بشكل طبيعي (نفس واحد في الثانية).
تحذير: الإيزوفلوران هو مخدر استنشاقي. استخدمها في مكان جيد التهوية وقلل من الاستنشاق. - أخرج الفأر من جهاز التبخير وضعه على ظهره على منشفة ورقية وافرد الأرجل.
- غط أنف الفأر بمخروط أنف (أنبوب متصل بجهاز التبخير يوفر جرعة إيزوفلوران مضبوطة تأتي في بعض وحدات التبخير) للحفاظ على التخدير.
- قم بخفقان المثانة بلطف لتحفيز التبول وضمان فراغ المثانة. امسح منطقة الإحليل بمسح 100٪ إيثانول. امسح إبرة اللقاحن/الحقنة، النقطة أولا، في مزلق الجراحة.
- قم بتطعيم كل فأر ب 50 ميكرولتر من محلول البكتيريا عن طريق إدخال إبرة التلقيح عبر الإحليل بطول حوالي 12 مم، والضغط برفق على مكبس الحقنة لتوزيع التلقيح في المثانة (10 ميكرولتر/ثانية). أزل إبرة التلقيح من الفأرة.
ملاحظة: العودة الفورية للتلقيح عند فتحة الإحليل عند بدء التلقيح تشير إلى إدخال غير صحيح أو غير كامل للإبرة. - أخرج الفأر من مخروط الأنف وأعيده إلى قفصه. كرر الخطوات 2.3-2.8 لكل فأرة. عندما/إذا كنت تغير حالة اللقاح/السلالات، تخلص من الحقنة وإبرة التطعيم في حاوية حادة معتمدة وابدأ من جديد من الخطوة 2.2.
ملاحظة: عادة لا يسبب التطعيم بالكائنات الممرضة للبول أعراض ألم شديدة. ومع ذلك، في حالات نادرة، قد يسبب إعطاء جرعات كبيرة من مسببات الأمراض الحمى، وانخفاض تناول الطعام والماء، وسلوكا غير طبيعي. يجب مراقبة صحة الحيوان طوال فترة التجربة. إذا لاحظت أعراض ألم واضحة، يمكن وضع مسكن مثل البوبرينورفين (0.05−0.1 ملغ/كغ تحت الجلد).
3. تعداد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا (IBC)
- قم بإزالة المثانة معقمة وضعها في 1x PBS في صفيحة ذات 6 آبار مع قاع سيليكوني. يمكن تحضير الصفائح باستخدام مجموعة مطاطية من السيليكون وصب حوالي 1 سم من السيليكون في كل بئر. اقطع المثانة إلى نصفين باستخدام المقص.
- باستخدام دبابيس معدنية صغيرة، فرد المثانة بلطف بحيث يكون تجويف المثانة متجها للأعلى. تأكد من وضع الدبابيس عند أطراف أقسام المثانة الخارجية لضمان تعريض أكبر كمية من البول.
- بعد التمدد، اغسل المثانة بلطف مرة واحدة باستخدام 1x PBS. قم بإزالة 1x PBS بواسطة الماصة. أصلح المثانة بإضافة كمية كافية من 3٪ بارافورمالديهيد لتغطية المثانة الممدودة بالكامل.
تحذير: البارافورمالديهايد مسرطن. يجب ارتداء معدات الحماية المناسبة، بما في ذلك القفازات، في جميع الأوقات. يجب أن تتبع التخلص من القوانين إرشادات المؤسسات. - حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. قم بإزالة محلول بارافورمالديهايد. اغسله مرة واحدة ب 1x PBS.
- اغسل بمحلول غسيل LacZ (2 ملليموتر MgCl2، 0.01٪ نوكسي كولات الصوديوم و0.02٪ نونيدت-p40 في 1x PBS) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في كل غسل.
- أزل محلول الغسيل وأضف كمية كافية من صبغة LacZ (محلول غسيل 9.5 مل LacZ، 0.4 مل 25 ملغ/مل X-gal، و0.1 مل من 100 ململ K-فيروسيانيد/K-فيريسيانيد) لتغطية المثانات. الحضانة عند 30 درجة مئوية طوال الليل محمية من الضوء.
- قم بإزالة المثانات الممدودة من الحاضنة ولاحظ الفتحات الالتهابية الالتهابية (IBCs)، التي تظهر كنقاط النقاط الزرقاء كما هو موضح من خلال منظار تشريح، بتكبير 40-60 مرة.
ملاحظة: أحيانا قد يتبول الفأر قبل وضع الأنبوب تحت الإحليل. في هذه الحالة، انتظر 15-20 دقيقة قبل محاولة جمع البول مرة أخرى.