توصيل النسخ الفيروسية المؤتلفة بواسطة الزراعة الكيميائية إلى شتلات الذرة لإسكات الجينات

الملخص

المصدر: بيرنينك، ب. م. وآخرون. التلقيح المباشر لشتلات الذرة عن طريق الحقن بفيروس فسيفساء ذيل الثعلب المؤتلف وفيروس فسيفساء قصب السكر المستنسخ المعدية. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو توصيل النسخ الفيروسية المؤتليفة بواسطة الزراعة البكتيريا إلى شتلات الذرة لإسكات الجينات. يوضح عملية عدوى البكتيريا الزراعية ، وانتشار الفيروسات الجهازية، والتغيرات الظاهرية الناتجة عن تداخل الحمض النووي الريبي.

البروتوكول

1. الحقن
ملاحظة: يمكن استخدام شتلات الذرة من عمر 4-7 أيام للحقن. يتأثر معدل نمو الشتلات بشكل كبير بظروف النمو، وكمية الإشعاع النشط ضوئيا (PAR) (أي ارتفاع PAR في الدفيئة مقارنة بغرفة النمو)، والنمط الجيني، وغيرها من الأمور التي قد يصعب التحكم بها في ظروف الاحتباس الحراري. يمكن حقن النباتات في عمر 4 أيام عندما يكون ارتفاعها 2-3 سم دون وجود أوراق متوسعة، وحتى عمر 7 أيام عندما تتوسع الورقة ذات الطرف المنخفض المستدير. ينخفض معدل نجاح هذه الطريقة بسرعة مع تقدم النباتات في العمر لأكثر من 7 أيام بعد الزراعة. موقع الحقن هو نفسه بغض النظر عن عمر الشتلات.

1. عند ارتداء نظارات الأمان، حقن التعليق البكتيري في الشتلات على ارتفاع 2-3 مم فوق عقدة الكوليوبتيلار باستخدام إبرة 25G × 5/8" متصلة بحقنة قابلة للاستخدام مرة واحدة بسعة 1 مل.
   ملاحظة: العقدة الكوليوبتيلار هي المكان الذي ستتكون فيه جذور التاج في النهاية. هذه هي أدنى عقدة في النبات. عادة، سيكون هناك تغير في اللون من الأخضر إلى الأبيض عند وتحت العقدة. موقع الحقن يقع فوق الميريستيم مباشرة. قد يساعد تشريح بعض الشتلات في هذه المرحلة في تصور موقع الميريستيم وبالتالي في تحديد موقع الحقن المناسب.
2. اضغط بلطف على الحقنة حتى تملأ التعليق الكوليوبتيل أو تصبح مرئية في الدائرة، حسب مرحلة نمو النبات. هذا يعادل تقريبا 100-200 ميكرولتر من التعليق.
   ملاحظة: إذا كان من الصعب حقن التعليق في الشتلة، فقد يكون موقع الحقن منخفضا جدا. الضغط المعتدل هو كل ما يجب أن يكون مطلوبا لحقن نظام التعليق.
3. حقن جميع الشتلات، وتغيير الحقن والإبر لكل تركيب.

2. العناية المستمرة بالنباتات

1. انقل الشتلات المحقونة إلى أواني بحجم 13 × 13 × 15 سم أو أكبر عندما تكون في عمر 7-8 أيام.
2. حافظ على ظروف النمو (فترة ضوئية 16 ساعة والتسميد مرة واحدة في الأسبوع).

3. تأكيد العدوى (ظاهريا)

1. تقييم النباتات بشكل ظاهري بين 14-21 يوما بعد التطعيم (DPI). يمكن رؤية الآفات الناتجة عن إسكات جينات السيطرة مثل آفة 22 أو فيتوين ديساتوراز بسهولة على الأوراق وتختلف عن أعراض FoMV.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حقن بحجم 1 مل	فيشر ساينتيفك	14955450	بدلا من ذلك، BD 309659
سلالة Agrobacterium tumefaciens GV3101			يحمل آلات نقل T-DNA مشفرة من بلازميد الفيروس، RifR، GmR، من مخزون المختبر
الأسمدة			بيترز سمد 15-15-15 مركز
الأواني الكبيرة	كوردلوك	SQL0550	5x5x4" أو أكبر. لزراعة الشتلات.
ذرة الذرة الذهبية بذرة الذرة الحلوة	المروج الأمريكية، بذور الساحل الغربي
ركيزة التربة	صنغرو للبستنة	SS#1-F1P	خليط Sunshine Mix #1/Fafard-1P، أي خليط تربة تنمو فيه الذرة بشكل جيد كاف