تأسيس الأغشية الحيوية البكتيرية والفطرية العابرة للمملكة لدراسة مسببات الأمراض الفموية

الملخص

المصدر: شلافر، س، وفروست كريستنسن، م. مراقبة الرقم الهيدروجيني خارج الخلية في الأغشية الحيوية عبر المملكة باستخدام المجهر الكونفوكلي. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو زراعة الأغشية الحيوية المجمعة المشوهة وكانديدا ألبيكانس عبر المملكة تحت ظروف شبيهة بالفم لنمذجة التفاعلات البكتيرية-الفطرية، مما يمكن دراسة التآزر الميكروبي، والالتصاق بالجلوكان، والضراوة الحمضية في مسببات الأمراض الفموية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بجمع العينات وفقا لإرشادات معهد جمع العينات (IRB).

1. زراعة الأغشية الحيوية عبر المملكة

1. ازرع Streptococcus mutans (S. mutans) DSM 20523 وCandida albicans (C. albicans) NCPF 3179 على صفائح الأجار الدموية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية تحت ظروف هوائية.
2. نقل مستعمرات فردية لكل كائن حي إلى أنابيب اختبار مملوءة ب 5 مل من حقن القلب في الدماغ (BHI). انمو لمدة 18 ساعة تحت ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية.
3. قم بجهاز الطرد المركزي في الزراعة الليلية عند 1,200 × جرام لمدة 5 دقائق. تخلص من الفائق، وأعد تعليق الخلايا في محلول ملحي فسيولوجي، وضبط OD_{550 نانومتر} إلى 0.5 لفطر C. albicans (~10⁷ خلايا/مل) وS. mutans (~10⁸ خلايا/مل). تخفيف تعليق S. mutans بنسبة 1:10 باستخدام محلول ملحي فسيولوجي معقم (~10⁷ خلايا/مل).
4. بيبت 50 ميكرولتر من محلول اللعابي المعقم، داخل آبار لوح بصري قاعي بسعة 96 بئر للمجهر. حضن الآبار لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. اغسل الآبار ثلاث مرات ب 100 ميكرولتر من محلول ملحي فسيولوجي معقم. أفرغ الآبار.
5. أضف 100 ميكرولتر من تعليق C. albicans إلى كل بئر. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. اغسلي ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي فسيولوجي معقم.
   ملاحظة: لا تفرغ الآبار بالكامل أثناء الغسيل. اترك خزانا بسعة 20 ميكرولتر لتجنب قوى القص الزائدة.
6. أضف 100 ميكرولتر من مصل البقر الجيني المعطل بالحرارة (معطل عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) إلى كل بئر. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. اغسلي ثلاث مرات باستخدام محلول ملحي فسيولوجي معقم. أفرغ الآبار، تاركا خزانا بسعة 20 ميكرولتر.
7. أضف 100 ميكرولتر من تعليق S. mutans (المحضر في الخطوة 1.3) إلى كل بئر. أضف 150 ميكرولتر من BHI يحتوي على 5٪ السكروز. احتضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أو أكثر. عند زراعة الأغشية الحيوية القديمة، غير الوسط يوميا إلى BHI الطازج. في نهاية مرحلة نمو الغشاء الحيوي عبر المملكة، اغسله 5 مرات بمحلول ملحي فسيولوجي معقم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
صفائح الأجار الدموية	معهد ستاتنز للمصل	677
حقن القلب في الدماغ	أكسويد	CM1135
حقن القلب في الدماغ + 5٪ سكروز	مستلزمات مختبرات BDH	10274
كانديدا ألبيكانس	المجموعة الوطنية للفطريات الممرضة	NCPF 3179
مصل الأبقار الجنيني	تقنيات جيبكو لايف	10270
جهاز الطرد المركزي المبرد GS-6R	بيكمان	لا يوجد
μ-لوحة 96 بئر أسود	إيبيدي	89626
المحلول الملحي الفسيولوجي المعقم	VWR	6404
المكورات العقدية المتحولة	Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen	DSM 20523
مقياس الطيف البصري V-3000PC	VWR	لا يوجد