$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير رقائق السيليكون
- تصميم هندسة قناة الميكروفلويديك في برنامج التصميم بمساعدة الحاسوب (CAD؛ انظر جدول المواد) وطباعتها على فيلم شفاف لإنشاء القناع الضوئي (الشكل 1A).
- قم بتصنيع القالب الرئيسي عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة (تحت ظروف غرفة نظيفة) باتباع الخطوات أدناه.
- اخبز رقاقة السيليكون على حرارة 200 درجة مئوية لمدة ساعتين.
- ضع الرقائق في مركز طبقة الطلاء الدورانية وصب مقاومة الضوء SU8 3050 (انظر جدول المواد) على الرقاقة. لف الطبقة عند 1,700 دورة في الدقيقة لمدة 40 ثانية مع زمن تدرج 10 ث/100 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: تم ضبط معايير الطلاء الدوراني للحصول على سمك مستهدف يبلغ 100 ميكرومتر لمحرك SU8 3050. - بعد عملية الطلاء الدوراني، يتم خبز رقاقة السيليكون برقة عند 65 درجة مئوية لمدة 600 ثانية و95 درجة مئوية لمدة 2700 ثانية. دع الويفر يبرد في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
ملاحظة: التبريد الليلي يعزز التصاق SU8 بالويفر. - ضع القناع الضوئي (الخطوة 1.1) على الرقاقة وتعريضه لأشعة فوق البنفسجية، بطاقة تعريض تبلغ 250 mJ/cm² وعلى طول موجي 350 نانومتر.
- بعد التعرض، اخبز الركيزة المكشوفة على 65 درجة مئوية لمدة 60 ثانية و95 درجة مئوية لمدة 300 ثانية.
- طور رقاقة السيليكون للحصول على القالب الرئيسي عن طريق غمرها في كأس مملوء بمطور mrDev600 (انظر جدول المواد). اهز الكأس بلطف لمدة 1800 ثانية لغسل المقاومة غير المبلمرة. ثم غسل الطلاء بالرش برش الأيزوبروبانول على رقاقة السيليكون وتجفيفه بالهواء.
- قم بخبز رقائق السيليكون بقوة على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 1800 ثانية.
- قم بتحويل القالب الرئيسي إلى سيلانية من خلال ترسيب بخاري 20 ميكرولتر من سيلان تريكلور (1H، 1H، 2H، 2H-بيرفلوروأوكتيل) (انظر جدول المواد) موضوعا على شريحة زجاجية بجانب القالب لمدة 40 دقيقة في جهاز تجفيف بالفراغ، مما يخلق ضغط قياسي يبلغ 100 ميليبار.
2. تصنيع جهاز الميكروفلويديك
ملاحظة: إجراء التصنيع الموضح هنا مخصص لجهاز ميكروفلويديك يحتوي على قناة ميكروفلويدية واحدة. ومع ذلك، يمكن تطبيق نفس الطريقة لتصنيع جهاز ميكروفلويديك يحتوي على عدة قنوات ميكروفلويدية بالتوازي.
- اخلط الإيلاستومر مع الرابط المتقاطع بنسبة 10:1 (انظر جدول المواد) لتحضير خليط بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS). حرك الخليط حتى يختلط بشكل متساو ويصبح معتما بسبب فقاعات الهواء المغلقة.
- قم بإزالة الغاز من الخليط في جهاز تجفيف الفراغ، مما يخلق ضغط مقياس 100 ملي بار حتى تزال فقاعات الهواء المحبوسة ويبدو شفافا. الوقت المطلوب لإزالة الغازات عادة 30 دقيقة.
- ضع القالب الرئيسي (الخطوة 1) في طبق زراعة الخلايا (انظر جدول المواد). صب 20 جرام من خليط PDMS على القالب الرئيسي لإنتاج قنوات بسماكة نهائية 5 مم.
- اخبز القالب الرئيسي على حرارة 70 درجة مئوية لمدة ساعتين.
- اقطع PDMS المعالجة حول قناة الميكروفلويديك (على مسافة تقارب 3 مم) باستخدام شفرة، ثم قم بتقشير قناة PDMS الميكروفلويدية عن القالب الرئيسي.
- لإنشاء مدخل ومخرج قنوات الميكروفلويد، قم بثقب ثقوب باستخدام ثقب خزعة (قطر 1.5 مم) في أطرافها (أعلى المثلثات، انظر الشكل 1A). قم بثقب ثقب إضافي في مركز مثلث المدخل لتركيب حساس الضغط لاحقا.
- اغسل شريحة زجاجية وقناة الميكروفلويديك بمحلول منظف متوفر تجاريا بنسبة 1٪ (انظر جدول المواد) لمدة 5 دقائق، ثم اشطفهما بماء منزوع الأيون. بعد ذلك، غسل قناة PDMS الميكروفلويدية والشريحة الزجاجية بالإيزوبروبانول. ثم اشطفها مرة أخرى بماء منزوع الأيون. جفف قناة PDMS الميكروفلويدية والشريحة الزجاجية بالهواء المضغوط على شريط واحد لمدة دقيقة واحدة.
ملاحظة: يجب أن يكون الهيكل المسامي لنظام PDMS جافا تماما لكي يكون الربط فعالا. - ضع شريحة الزجاج وقناة الميكروفلويديك في منظف بلازما (انظر جدول المواد) وتأكد من أن الأسطح المراد ربطها تواجه الأعلى. شغل منظف البلازما وعالج قناة الميكروفلويديك والشريحة الزجاجية ببلازما هوائية بتدفق هواء 1 SL/h (لتر قياسي في الساعة) لمدة دقيقة واحدة. اربط قناة الميكروفلويديك بالشريحة الزجاجية فور إخراجها من المنظف عن طريق وضعهما على اتصال ببعضهما البعض.
ملاحظة: تأكد من عدم لمس الأسطح المعالجة، لأن ذلك قد يؤثر على التماسك. عند تصنيع جهاز ميكروفلويديك يحتوي على قنوات ميكروفلويدية متعددة، عرض القنوات الميكروفلويدية في نفس الوقت وربطها في خطوة واحدة. - ضع الجهاز الميكروفلويديك المرتبط على صفيحة ساخنة بدرجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
- خزن جهاز الميكروفلويديك في طبق زراعة خلايا نظيف حتى تبدأ التجربة.
3. تحضير التعليق البكتيري
- ازرع مجموعة من Bacillus subtilis NCIB 3610 لمدة 20 ساعة قبل بدء التجربة عن طريق تلقيح 3 مل من وسط زراعة المرق المغذي رقم 3 (انظر جدول المواد) من مخزون جليسرول مجمد في أنبوب زراعة بسعة 15 مل. الحضانة في حاضنة هزة عند 30 درجة مئوية وسرعة 200 دورة في الدقيقة طوال الليل (لمدة 16 ساعة).
- قم بعمل زراعة فرعية من الزراعة الليلية قبل 4 ساعات من بدء التجربة بإضافة 3 ميكرولتر من الثقافة الليلية في 3 مل من وسط الزراعة الطازج (تخفيف 1:1,000) في أنبوب زراعة بحجم 15 مل. حضن الزراعة الفرعية في حاضنة اهتزاز عند 30 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3.5-4 ساعات للحصول على كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀₀) تبلغ 0.1.
4. تجربة نمو الأغشية الحيوية
- شغل حاضنة الصندوق في المجهر قبل التجربة بثلاث ساعات لضمان درجة حرارة مستقرة تبلغ 25 درجة مئوية. قم بتركيب مضخة الحقنة وحساسات الضغط (انظر جدول المواد).
- وصل أنابيب المدخل والمخرج بجهاز الميكروفلويديك. أدخل إبرة مباشرة (بقطر خارجي 0.6 مم) في أنبوب السحب لتثبيت الاتصال بين الأنبوب والحقنة.
- ضع جهاز الميكروفلويد، و30 مل من الماء منزوع الأيون، و30 مل من وسط الزراعة في مجفف فراغ وقم بإزالة الغازات منهما لمدة ساعة على الأقل. ثم اسحب وسط الزراعة والماء منزوع الأيونات ببطء إلى حقنتين منفصلتين بسعة 30 مل.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لمنع تكون الفقاعات في القناة أثناء التدفق مع وسط الزراعة. - قم بتركيب جهاز الميكروفلويديك على المجهر وضع أنبوب المخرج في حاوية نفايات.
- قم بتوصيل الحقنة المملوءة بالماء منزوع الأيونات بقناة الميكروفلويديك عبر أنبوب الميكروفلويديك وحقن الماء ببطء حتى يخرج من مخرج حساس الضغط. املأ حساس الضغط بالماء ونظف جميع الفقاعات من الأنبوب الذي يربط قناة الميكروفلويديك وحساس الضغط. أغلق مخرج حساس الضغط مع البراغي المخصصة لحساس الضغط.
ملاحظة: تضمن عملية التعبئة الموصوفة تسجيل تغيرات الضغط عند مدخل قنوات الميكروفلويديك بدقة. عند إجراء تجربة باستخدام قنوات ميكروفلويدية متعددة، قم بتوصيل كل قناة بحقنة منفصلة لضمان تساوي ظروف التدفق في جميع القنوات.
- املأ بقية قناة الميكروفلويديك بالماء منزوع الأيون.
- ضع فلتر بحجم 1.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على حقنة وسائط الثقافة. بعد ذلك، أزل حقنة الماء وربط حقنة وسط الزراعة بعناية بأنبوب المدخل الميكروفلويديك. ركب الحقنة على مضخة الحقنة وغسل القناة مع وسط الزراعة بمعدل تدفق 2 مل/س لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة: يمنع الفلتر دخول الخلايا البكتيرية إلى الحقنة أثناء التحميل. سيؤدي غسل قناة الميكروفلويديك بوسط الزراعة إلى إزالة الفقاعات المتبقية في البنية المسامية. - اضبط مضخة الحقنة على معدل التدفق المطلوب (هنا 1 مل/ساعة) أثناء التجربة واضبط قراءة ضغط حساسات الضغط على الصفر.
ملاحظة: بضبط قراءة الضغط الأولية على الصفر، سيتم قياس فرق الضغط الناتج عن تطور الأغشية الحيوية أثناء التجربة فقط. - بيبت 1 مل من مزرعة البكتيريا عند OD₆₀₀₀ بقيمة 0.1 إلى قارورة طرد مركزي بسعة 1.5 مل. قم بتحميل الزراعة البكتيرية في قناة الميكروفلويديك عن طريق وضع أنبوب المخرج في قارورة الطرد المركزي. بعد الانتظار لمدة 5 دقائق لإزالة أي فقاعات هواء محتملة من مخرج الأنابيب، اسحب 150 ميكرولتر من محلول البكتيريا بمعدل تدفق 1 مل/س، حتى يتم ملء القناة الميكروفلويدية بزراعة البكتيريا.
- قم بإزالة فلتر حقنة وسط الزراعة بعناية وضع المخرج في حاوية النفايات. اترك الخلايا البكتيرية في ظروف تدفق صفري في القناة الميكروفلويدية لمدة 3 ساعات للسماح بارتباطها السطحي بالوسط المسامي.
ملاحظة: ترك الخلايا البكتيرية في ظروف تدفق صفر لمدة 3 ساعات كان محسنا لتثبيت السلالة البكتيرية المستخدمة مع ضمان زراعة بكتيرية مؤكسجة جيدا. قد تتطلب سلالات بكتيرية أخرى وقتا أكثر أو أقل. - لبدء التجربة، ابدأ التدفق بضبط مضخة الحقنة على معدل التدفق المطلوب (هنا 1 مل/ساعة) وابدأ قراءة الضغط عند 1 هرتز.
- التقاط صور للغشية الحيوية النامية عند الفاصل الزمني المطلوب، والتكوين البصري، والتكبير.
ملاحظة: في هذه الدراسة، تم التقاط صور بتكبير 4x في وضع المجال الساطع في 18 موقعا تمتد عبر كامل مجال الوسط المسامي كل 6 دقائق لمدة 24 ساعة.
