$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تلقيح البكتيريا
- تحديد عدد البكتيريا التي سيتم تلقيحها بالإشارة إلى القياس المستخدم لتحديد التصاق البكتيريا ومدة الحضانة.
- بالنسبة للدراسات المجهرية التي تتضمن فترات حضانة أقل من يوم واحد، قم بتطعيم أعداد كبيرة نسبيا من البكتيريا. أضف كمية من الزراعة للوصول إلى تركيز بكتيريا نهائي يزيد عن 106 بكتيريا لكل مل. لفترات حضانة أطول، قلل من حجم اللقاح البكتيري.
- بالنسبة للدراسات التي سيتم فيها قياس التصاق البكتيريا بواسطة عدد الخلايا القابل للحياة، أضف كمية من الزراعة للوصول إلى تركيز نهائي من 10إلى 3 إلى 106 بكتيريا لكل مل.
- تجنب إضافة الكثير من البكتيريا بحيث يغير الأيض الرقم الهيدروجيني أو تركيز الأكسجين في وسط الحضانة. قس الرقم الهيدروجيني باستخدام ورق الرقم الهيدروجيني أو قطب كهربائي. قس تركيز الأكسجين باستخدام قطب أكسجين.
- بالنسبة للنباتات المزروعة في الرمل، قم بتلقيح بثلاث طرق ممكنة.
- قم بتلقيح البذور بالبكتيريا قبل الزراعة عن طريق نقع البذور لمدة دقيقة واحدة في محلول معلق في ماء يحتوي على حوالي 10إلى 6 بكتيريا في المل.
- قم بتطعيم الجذر عن طريق إنبات شتلات أكسينية. عندما يكون طول جذر الشتلة حوالي 1 سم، غمسه أو ضع الشتلة كاملة في محلول يحتوي على 10أو 6 بكتيريا لكل مل في الماء لمدة دقيقة واحدة.
- قم بتطعيم الرمل بخلط البكتيريا مع الرمل قبل الزراعة للحصول على تركيز نهائي حوالي 10إلى 3 بكتيريا لكل مل أو عن طريق ري الشتلة بتعليق 10إلى 6 بكتيريا في كل مل بعد الزراعة.
2. حضانة البكتيريا مع المادة النباتية
- للحضانة في وسط سائل، حضن البكتيريا مع المادة النباتية في ماء معقم أو أملاح السكروز والمعادن أو وسط زراعة أنسجة النبات (مثل تخفيف بنسبة 1:10 من خليط ملح موراشيغ وسكوغ القاعدي أو أملاح التصلب المولوث).
- استخدم وعاء لا تلتصق به البكتيريا. حاول إبقاء سطح النبات مغطى باستمرار، إما بالغمر أو بتحريك لطيف. قد يمنع التحريك القوي الالتصاق أو حتى يزيل البكتيريا من سطح النبات.
- راقب المادة النباتية في المجهر الضوئي بعد فترات زمنية مختلفة لتحديد متى توقف الحضانة وإجراء القياسات. غالبا ما يكون مسار الالتصاق الزمني ذا قيمة مع أخذ عينات كل 1 إلى 4 ساعات أو يوميا، حسب سرعة التفاعل.
- للحضانة في الرمل، تطبيق نفس الاعتبارات الموصوفة للحضانة في وسط سائل في الخطوة 2.1.
3. قياس الالتصاق باستخدام المجهر
- قم بإجراء قياسات مجهرية باستخدام عدسات Nomarski أو بصريات التباين الطور لتسهيل رؤية البكتيريا على الأسطح. ومع ذلك، يمكن استخدام أي مجهر ذو مجال ساطع بتكبير 20 ضعف أو أكثر.
- استخدم الملاحظة المجهرية لتحديد ما إذا كانت البكتيريا موزعة عشوائيا أو موجودة في مواقع محددة. أيضا، تحقق مما إذا كانت مرتبطة بشكل فردي أو في مجموعات. ابحث عن وجود مستعمرات دقيقة تشير إلى نمو أو احتجاز بكتيريا بعد الالتصاق. تحقق مما إذا كانت البكتيريا تبدو وكأنها تشكل طبقة حيوية على السطح.
ملاحظة: الغشاء الحيوي هو عدد كبير من البكتيريا المرتبطة بالسطح ومحاطة بمصفوفة خارج الخلية. قد يكون الهيكل أملسا وموحدا أو له هندسة معمارية أكثر تعقيدا. - استخدم بكتيريا موسومة بعلامة فلورية. إذا كانت هناك بكتيريا أخرى وتم تحديد البكتيريا المعنية بواسطة علامة فلورية مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، استخدم المجهر الفلوري لتحديد وجود البكتيريا الموسومة في مجموعات من البكتيريا الأخرى. بالنسبة ل GFP، استخدم فلترا بإثارة 490 نانومتر وانبعاث 520 نانومتر.
- تحقق من أن علامة الفلورسنت لا تؤثر سلبا على البكتيريا من خلال ملاحظة التصاق المادة المحورية لخليط متساو من البكتيريا البرية والبكتيريا الموسومة من نفس السلالة باستخدام كل من النومارسكي والعدسات الفلورية. إذا تم خلط البكتيريا الفلورية والداكنة عشوائيا وموجودين بأعداد متساوية، فإن العلامة لم تتداخل مع الاختبار.
- حدد عدد البكتيريا المرتبطة.
ملاحظة: من الصعب جدا تحديد عدد البكتيريا الملتصقة في المجهر. عندما يكون الارتباط بأسطح النباتات غير المنتظمة، عادة لا يكون من الممكن الحصول على قياس كمي. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (الذي لم يناقش في هذا المقال) لإجراء مثل هذه القياسات.- عندما تكون البكتيريا مرتبطة بسطح أملس، مثل شعرة الجذر، عد عدد البكتيريا المرتبطة بحافة شعر الجذر لكل ملم من طول شعر الجذر. احرص على استخدام شعيرات الجذور بنفس الحجم والشكل تقريبا عند مقارنة القياسات.
- لتحديد حجم الأجسام في المجهر، استخدم شريحة تجارية تحمل علامات مقاسة. راقب وصور هذه الشريحة بنفس الإعدادات المستخدمة للمادة التجريبية واستخدم الصور الناتجة لتحديد حجم الأجسام في الصور المجهرية.
- جهز العينة للمجهر.
- اغسل العينة. انقل العينة إلى قطرة ماء أو وسط حضانة على شريحة مجهر وراقبها مباشرة.
ملاحظة: هذا له ميزة أنه إذا لم يكن هناك نمو بكتيريا أو موت فعلي، فمن غير المرجح أن يكون هناك الكثير من البكتيريا الحرة. خذ غياب البكتيريا الحرة كعلامة تحذيرية على احتمال حدوث موت بكتيريا أو ارتباط بكتيريا بالوعاء الذي أجريت فيه الحضانة. يظهر تأثير غسل العينة في الشكل 1. - اغسل العينة بلطف في ماء أو وسط حضانة بوضعها في قارورة سائلة وقلب القارورة برفق. ثم ضع العينة على شريحة المجهر في سائل طازج للمراقبة.
- قم بتركيب العينة في سائل باستخدام غطاء عادي وشريحة مجهرية.
- إذا كانت العينة سميكة وبالتالي ستظهر انتفاخا تحت غطاء الغطاء، استخدم غطاء الضغط والطبق. تحتوي هذه الألواح على حلقة من المطاط أو البلاستيك حول حافة الغطاء. ضع السائل والعينة في البئر داخل شريحة الغطاء، ثم ضع الشريحة فوقها واضغط برفق لإغلاق انزلاق الغطاء على الشريحة. اقلب وافحص الآن.
- بدلا من ذلك، استخدم شريحة عد الطحالب وغطاء الغطاء بطريقة مشابهة. لاحظ أن الشرائح ذات هذا العمق لا يمكن فحصها عادة بعدسة موضوعية أكبر من 20 مرة.
