تكوين حبيبات الإجهاد أثناء عدوى شيجيلا في خلايا ظهارية سرطانية

الملخص

المصدر: فونيش، ب. وآخرون، تحليل التألق المناعي لتكوين حبيبات الإجهاد بعد التحدي البكتيري لخلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2017)

يظهر هذا الفيديو إصابة الخلايا الظهارية بالبكتيريا الممرضة شيجيلا فليكسنيري والاستجابة الخلوية الناتجة عن المضيف. تعطل بروتينات المؤثر البكتيري ترجمة المضيف، مما يؤدي إلى تكوين عضيات بدون غشاء تسمى حبيبات الإجهاد، والتي تعكس استجابة الخلية التكيفية للعدوى.

البروتوكول

1. تحضير البكتيريا وخلايا المضيف

1. انقل انزلاقات غطاء زجاجي بقطر 12 أو 14 مم في صفيحات بسعة 24 أو 12 بئر على التوالي، باستخدام ملقط معقم، مع احتساب بئر واحد لكل حالة تجريبية. قم بتعقيم هذه القطع بالعلاج بالأشعة فوق البنفسجية (UV) في غطاء زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: يشمل آبار التحكم في تحدي البكتيريا وتحفيز حبيبات الإجهاد (SG) بواسطة الإجهادات الخارجية.
2. بالنسبة لصفيحة ب 24 بئر مع غطاء 12 مم، قم بزرع 1 ×^{10 5} خلايا ثديية (مثل خلايا HeLa) على الغطاء الداخلي؛ اضغط على الغطاء برأس ماصة معقمة. دع الخلايا تلتصق طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة أنسجة بنسبة 5٪_CO2 في وسط زراعة مناسب لكل نوع من الخلايا.
   ملاحظة: تجمع الخلايا بحيث يكون التقاء الخلايا بين 40 إلى 60٪ في اليوم التالي.
   1. بالنسبة لخلايا HeLa، يتم حضانه في وسط Eagle المعدل (DMEM) من Dulbecco باستخدام الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) ومصل العجل الجيني الخالي من المكملات بنسبة 10٪ (FCS). قم بتقليل الفرك سكوس عن طريق التسخين لمدة 30 دقيقة في حمام ماء بدرجة حرارة 56 درجة مئوية، مع تدوير المصل مرة واحدة بعد 15 دقيقة.
3. لإزالة البكتيريا، استخدم رأس ماصة معقمة لإزالة كمية صغيرة من مخزون الجلسرول البكتيري (20٪ جليسرول) المخزن في فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية وضعه على طبق معين. استخدم حلقة معقمة لتوزيع البكتيريا على حوالي 10٪ من اللوحة. استخدم حلقة معقمة جديدة واسحبها عبر الطلاء لصنع 3 خطوط متوازية، بطول نصف صفيحة. امتد عبر هذه الخطوط، مغطيا بقية اللوحة. حضانة صفيحة O/N عند 37 درجة مئوية.
   1. اختر مستعمرة بكتيرية واحدة (مثل Shigella flexneri) من الصفيحة المخططة حديثا. تجنب العمل مع مستعمرات بكتيرية عمرها أكثر من أسبوع.
   2. بالنسبة لسلالة S. flexneri M90T، قم بتلقيح مستعمرة حمراء من طبق أجار الصويا التربتيكي 0.1٪ من الأجار الأحمر الكونغولي في 8 مل من مرق الصويا التريبتي في أنبوب بسعة 15 مل؛ شد الغطاء وحضانة الرج عند 222 دورة في الدقيقة O/N عند 30 درجة مئوية. تحذير: لا تستخدم مستعمرات بيضاء كبيرة لأنها فقدت بلازميد الضراوة وغير معدية.

2. التحدي البكتيري لخلايا المضيف

1. جهز البكتيريا لتعظيم إمكانية العدوى.
   1. بالنسبة ل S. flexneri، تقوم بزراعة البكتيريا الفرعية بإضافة 150 ميكرولتر من الأكسجين إلى 8 مل من أجار الصويا التريبتيكي وحضانة الرج عند 222 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية إلى المرحلة الأسية المتأخرة (~2 ساعة) لتحفيز التعبير الجيني الضراوة وتعزيز العدوى.
      1. عندما تكون كثافة الزراعة بين 0.6 و0.9 (المقاسة عند 600 نانومتر)، انقل 1 مل من الثقافة إلى أنبوب بسعة 1.5 مل. بكتيريا الحبيبات لمدة دقيقتين عند 8,000 x جرام وإعادة تعليقها في وسط العدوى (DMEM مع NEAA، بدون متلازمة الألياف الصلبية) عند OD₆₀₀ = 1. لذا، إذا كان OD₆₀₀ هو 0.85، أعد تعليقه في 850 ميكرولتر.
         ملاحظة: بالنسبة ل S. flexneri، عند OD₆₀₀ = 1، سيكون هناك 8 × 10⁸ بكتيريا لكل مل عند زراعتها في وسط 8 مل. تعدد العدوى (MOI) بقيمة 20 هو المناسب. بالنسبة لمسببات الأمراض الأخرى، يجب تحديد عدد البكتيريا لكل مل عند OD₆₀₀ وMOI المناسب تجريبيا.
   2. لتعزيز التفاعلات بين البكتيريا والمضيف، قم بتغطية البكتيريا بمادة بولي-إل-ليسين (PLL).
      ملاحظة: علاج PLL ل S. flexneri لم يؤثر على ديناميكيات ال SG. يجب تقييم مسببات الأمراض الأخرى من حيث قابليتها لعلاج PLL.
      1. لتغطية البكتيريا ب PLL، قم بطرد مركزي بمقدار 1 مل من الزراعة البكتيرية لمدة دقيقتين عند 8,000 × جرام، ثم إعادة تعليق الحبيبات في 10 ميكروغرام/مل PLL في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عند OD₆₀₀ = 1.
      2. أضف المحلول البكتيري إلى طبق صغير، مثل بئر داخل لوح يحتوي على 12 بئرا، وحضن عند RT (~20 °C) لمدة 10 دقائق مع تحريك لطيف على هزة الطبق.
      3. استخدم بكتيريا الحبيبات لمدة دقيقتين عند 8,000 × جرام، وأزل الزائد. أعد تعليق الحبيبة في 1 مل PBS وكرر هذه الخطوة مرتين. بعد الغسل النهائي، أعد تعليقها في وسط العدوى عند جرعة زائدة₆₀₀ = 1.
         ملاحظة: هنا، الوسط الملوى ل S. flexneri هو وسط خلية مضيفة يحتوي على 20 ملليمولار N-(2-هيدروكسي إيثيل)بيبرازين-N'-(2-حمض الإيثانيسلفونيك) (HEPES) بدون FCS.
2. جهز الخلايا لمواجهة البكتيريا.
   1. إزالة وسط من خلايا HeLa الثديية باستخدام مضخة شفط. أضف وسط خلايا HeLa بسعة 500 ميكرولتر RT لغسل الخلايا، ثم الدوران، وإزالة الوسط باستخدام مضخة شفط، واستبدله بوسط عدوى مناسب بدرجة حرارة الغرفة (RT) بدرجة حرارة الغرفة (RT) ب 500 ميكرولتر (مثل وسط الخلية المضيفة بسعة 20 مللي مولار HEPES بدون FCS).
   2. ملاحظة: في جميع خطوات الغسيل، اعمل بسرعة وقم بمعالجة حتى 4 أغطية في كل مرة لتجنب جفاف الخلايا.
3. جهز تشالنج خلايا HeLa بالبكتيريا لإصابة 20 - 50٪ من الخلايا.
   ملاحظة: يجب تحديد الوقت المناسب وMOI لكل نوع من أنواع البكتيريا. بشكل عام، البداية الجيدة هي 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع MOI 10.
   1. بالنسبة ل S. flexneri، تحدى خلايا HeLa باستخدام إحدى الطريقتين (الخطوة 2.3.1.1 أو 2.3.1.2).
      1. قم بتدوير البكتيريا غير المعالجة ب PLL (20 ميكرولتر من OD₆₀₀ = 1/بئر من صفيحة 24 بئر في وسط 500 ميكرولتر) على الخلايا لمدة 10 دقائق عند 13000 × جرام.
      2. أضف البكتيريا المغلفة ب PLL (15 ميكرولتر من OD₆₀₀ = 1/بئر من صفيحة 24 بئر في وسط 500 ميكرولتر) لمدة 15 دقيقة عند RT للسماح للبكتيريا بالاستقرار على الخلايا.
   2. السماح بالعدوى بالحدوث عن طريق وضع الخلايا التي تحتوي على بكتيريا مستقرة في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: لفترات زمنية قصيرة، قم بمزامنة عدوى S. flexneri بوضع الألواح في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة بدلا من حضانة زراعة الأنسجة.
4. أوقف العدوى بغسل الخلايا.
   1. لغسل الخلايا وإزالة البكتيريا الزائدة، قم بإزالة الوسط باستخدام مضخة شفط، أضف 1 مل من وسط زراعة هيلا الطازج المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) (DMEM، 10٪ FCS، NEAA). لف الوسط، أزله واستبدله بوسط جديد. كرر العملية مرتين واترك وسط جديد على الخلايا.
      1. بالنسبة ل S. flexneri أو البكتيريا داخل الخلية الأخرى، بعد إصابة خلايا HeLa والغسالات، يجب استبدال الوسط بوسط زراعة نسيج قياسي يحتوي على 50 ميكروغرام/مل جنتاميسين لقتل البكتيريا خارج الخلية ومنع المزيد من الغزو الخلوي.
         ملاحظة: لا تضيف مضادات حيوية إلى وسط البكتيريا خارج الخلية.
5. حضن البكتيريا مع الخلايا للفترة المطلوبة في حاضنة زراعة الأنسجة.
   ملاحظة: بالنسبة ل S. flexneri، قد تصل مدة العدوى إلى 6 ساعات، حسب نوع الخلية. بالنسبة لخلايا HeLa، دع العدوى تستمر لمدة 1.5 - 2 ساعة قبل إضافة إجهادات خارجية لتحفيز تكوين SG. بالنسبة لعدوى كاكو-2، التي تنتشر فيها شيجيلا من خلية إلى أخرى، قم بالإصابة لمدة 30 دقيقة إلى 6 ساعات قبل إضافة إجهاد خارجي. يمكن تثبيت الخلايا في هذه المرحلة دون إضافة ضغوط خارجية لتقييم تكوين الخلايا السكينية نتيجة العدوى البكتيرية.

3. التثبيت وتحليل التألق المناعي لتكوين حبيبات الإجهاد

ملاحظة: معالجة الانزلاق التجريبي والتحكم في نفس الوقت لتجنب اختلافات التلوين التي قد تؤثر على تحليل الصورة في الخطوات التالية. تشمل عينات الضابطة عدم وجود عدوى مع أو بدون علاج محفز للسك سغ، وعينات مصابة مع وبدون علاج محفز لل SG.

1. إزالة الوسط بالكامل باستخدام مضخة شفط وثبت العينات بإضافة 0.5 مل RT 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في PBS. حضانة لمدة 30 دقيقة في RT.
   تحذير: PFA ضار بالمعالج والبيئة. اتخذ الإجراءات المناسبة لحماية المعالج والتخلص من النفايات الكيميائية.
   ملاحظة: بدلا من ذلك، ثبت لمدة 15 دقيقة ثم استبداله بميثانول مبرد مسبقا بدرجة -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للحفاظ على تحديد مواقع سيتوبلازم لعلامات SG.
2. قم بإزالة PFA باستخدام ماصة وتخلص من السائل في وعاء نفايات مناسب. اغسل غطاء الغطاء بمحلول ملحي مخزن بسعة 1 مل (TBS: 25 ملليمول تريس، درجة حموضة 7.3؛ 15 ملليمولار كلوريد الصوديوم، NaCl). حضن غطاء الغطاء لمدة دقيقتين مع هز خفيف على هز الطبق أثناء الغسيل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شيغيلا فليكسنيري			متوفر من مختبرات مختلفة عند الطلب
مرق الصويا بالكازين (TCS) بالتريبتون	بكالوريوس العلوم الحيوية	211825	وسط النمو القياسي لشيجيلا، التطبيق - نمو بكتيريا
أجار TCS	بكالوريوس العلوم الحيوية	236950	آجار النمو القياسي لشيجيلا، التطبيق - نمو البكتيريا
الأحمر الكونغوي	سيرفا للرحلان الكهربائي GmbH	27215.01	أداة التمييز لشيجيلا التي فقدت بلازميد الضراوة، التطبيق - نمو البكتيريا
بولي-إل-ليسين (PLL)	سيغما-ألدرتش	P1274	مفيد لتغطية البكتيريا لزيادة العدوى، التطبيق - العدوى
جنتاميسين	سيغما-ألدرتش	G1397	القتل الانتقائي للبكتيريا خارج الخلية ولكن ليس البكتيريا السيتوزوليكية، التطبيق - العدوى
هيبس	تقنيات الحياة	15630-056	يكون مخزن الرقم الهيدروجيني مفيدا عندما يتم حضن الخلايا في RT، التطبيق - زراعة الخلايا
المتوسط المعدل من دولبيكو (DMEM)	تقنيات الحياة	31885	وسط زراعة قياسي لخلايا HeLa، التطبيق - زراعة الخلايا
مصل العجل الجنيني (FCS)	بيوويست	S1810-100	مكمل 5٪ يستخدم في وسط زراعة الخلايا HeLa، التطبيق - زراعة الخلايا
الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)	تقنيات الحياة	11140	تخفيف 1:100 المستخدم في وسط زراعة الخلايا HeLa، التطبيق - زراعة الخلايا
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)	سيغما-ألدرتش	D2650	مخفف الكاشف، التطبيق - زراعة الخلايا
بارافورمالديهايد (PFA)	مشاهد المجهر الإلكتروني	15714	يستخدم 4٪ من PFA للتثبيت القياسي للخلايا، التطبيق - التثبيت
لوحة زراعة الخلايا ذات 24 بئر	سيغما-ألدرتش	CLS3527	ألواح زراعة الأنسجة القياسية، التطبيق - زراعة الخلايا
أغطية زجاجية بقياس 12 مم	نيوفيترو	1001/12	دعم زراعة الخلايا لتطبيقات المناعة الفلورية، التطبيق - دعم الخلايا
الملقط	سيغما-ألدرتش	81381	وسط تركيب رخيص ومتين يعمل جيدا لمعظم الفلوروفورات، التطبيق - التركيب