التصوير الفلوري لاستعمار البكتيريا في أنسجة كلى الفئران

الملخص

المصدر: بهيرا، ر. ك. وآخرون. طريقة قائمة على الفلورة لدراسة تنظيم جينات البكتيريا في الأنسجة المصابة. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو طريقة لتحضير أنسجة كلوية الفئران المصابة، وتلوين الحمض النووي، واكتشاف تعبير جينات البكتيريا باستخدام مراسلين فلوريين مزدوجين. الأحمر يحدد جميع البكتيريا، واللون الأخضر يبرز الخلايا المستجابة للعدوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوانات المختصة.

1. حصاد الأعضاء ومعالجة الأنسجة
   1. قتل الحيوانات عن طريق استنشاق_ثاني أكسيد الكربون وانخلاع عنق الرحم كطريقة ثانوية، وإجراء التشريح.
   2. احصد الكلية (على اليمين) وأعضاء حيوية أخرى (القلب، الكبد، الرئتين، الطحال) وانقله إلى أنابيب بولي بروبيلين بحجم 15 مل تحتوي على 10٪ [v/v] فورمالين مخزن.
   3. دع الأعضاء تستقر في الظلام عند درجة حرارة الغرفة مع هز أو تدوير لطيف لمدة لا تقل عن 24 ساعة ولكن لا تزيد عن 48 ساعة.
   4. قم بإدخال الأعضاء في وسط شفاف لتجميد الأنسجة وتخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية.
   5. باستخدام جهاز تجميد الميدان، قسم الأنسجة إلى شرائح بسماكة 10 ميكرومتر.
   6. جفف الأجزاء على شريحة زجاجية مشحونة ومنظفة مسبقا لمدة 20 دقيقة في الظلام. ضع وسط تثبيت صلب مع صبغة 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وغطاء داخلي. تركيب شرائح التثبيت في درجة حرارة الغرفة طوال الليل ونقلها إلى 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
2. المجهر الكونفوكالي بالمسح بالليزر ومعالجة الصور
   1. افحص الشرائح المثبتة لتحديد الآفات باستخدام الليزر المناسب للمسجل الفلوري المستخدم. في هذه الحالة، تستخدم إشارات التألق الأخضر (GFP أو البروتين الفلوري الأخضر)، الأحمر (tdTomato)، والأزرق (DAPI).
   2. احصل على الصورة باستخدام الهدف المناسب لتصوير الخلايا الفردية (مثلا، عادة ما تستخدم أهداف 20x أو 40x).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فئران C57Bl/6	نهر تشارلز	NA
مجهر الليزر الكونفوكال الماسح	زايس	NA
الميكروتوم الكريوستات	ثيرمو ساينتفيك	NA
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	سيلجرو	46-013-CM
متجانس بريسيلليس 24	مختبرات بيرتين	NA
وسط تجميد الأنسجة الشفاف تحت Xero	مرسيدس ميديكال	MER5000
شرائح المجهر سوبرفروست بلس	فيشر ساينتيفك	12-550-15
وسيط تركيب Vectashield Antifade مع DAPI	مختبرات فيكتور	H-1500