التغيرات الشكلية في البكتيريا باستخدام المجهر الفلوري للخلايا الحية

الملخص

المصدر: برزوزوفسكي، ر. س. وآخرون. المجهر الفلوري للخلايا الحية لدراسة مواقع البروتينات تحت الخلية وتغيرات شكل الخلايا في البكتيريا. J. Vis. Exp. (2019)

يعرض هذا الفيديو مجهر فلورة الخلايا الحية لرؤية التغيرات الشكلية في الوقت الحقيقي للبكتيريا. يوضح الخطوات المتضمنة في التصوير، واكتساب التايم لابس، وفك الالتفاف للحصول على صور عالية الدقة في الوقت الحقيقي.

البروتوكول

1. التصوير

1. في يوم التجربة، شغل نظام المجهر. ابدأ برنامج التصوير (انظر جدول المواد) بالنقر على الأيقونة المناسبة على سطح المكتب. قم بتهيئة المجهر بالنقر على خيار تهيئة المجهر (الزر الموضح مع المجهر) في مربع حوار بدء التشغيل في البرنامج. تأكد من أن الهدف منخفض بالكامل باستخدام ضبط المجهر الخشن قبل التهيئة.
   ملاحظة: بعد التهيئة السريعة، يجب أن تظهر ثلاثة مربعات حوار إضافية بالإضافة إلى قائمة ابدأ: resolve3D، جمع البيانات، ومراقب التصفيات.
2. ضع قطرة زيت بمقدار 1.517 (معامل الانكسار) على هدف الغمر بالزيت بمقدار 100x الذي زودته الشركة المصنعة (الفتحة الرقمية = 1.4، مسافة العمل = 0.12 مم؛ انظر جدول المواد).
   ملاحظة: من المهم اختيار زيت الغمر المناسب لدرجة حرارة إجراء التصوير.
3. حمل الطبق الزجاجي السفلي الذي يحتوي على العينة في الهيكل المعدني (التابوت) وقم بتمريره بلطف داخل مشبك المسرح.
4. استخدم مقبض الضبط الخشن لرفع الهدف حتى يلامس الزيت قاع الزجاج للطبق. استخدم العدسة وزر الضبط الدقيق لجعل العينة واضحة التركيز. بمجرد أن تكون الخلايا في بؤرة التركيز، قم بتدوير المقبض من العدسة العينية إلى وضع الكاميرا عن طريق تحريك مفتاح الاختيار الموجود في مقدمة جسم المجهر إلى اليسار.
5. ابدأ التجربة باستخدام برنامج التصوير. في نافذة resolve3D ، اختر أيقونة التصميم/تشغيل التجربة التي تظهر بواسطة قارورة. يجب أن يظهر مربع حوار جديد بعنوان تصميم/تجربة تشغيل.
   1. حدد عدد مكدسات Z وسماكة العينة باستخدام تبويب التصميم ثم التقسيم في مربع حوار التصميم/التجربة التشغيلية .
      ملاحظة: في قسم النتائج التمثيلية، تم استخدام 17 مكدس Z بفاصل 200 نانومتر للصور الثابتة وأربعة مكدسات Z بفاصل 200 نانومتر للمجهر الزمني الصحيح.
   2. لقياس سمك الخلايا في العينة، قم بضبط مستوى Z يدويا تدريجيا باستخدام الأسهم للأعلى والأسفل في مربع حوار resolve3D . حدد مكان خروج الخلايا عن التركيز كحد أعلى وأسفل لالتقاط الصورة. استورد هذه المعلومات قبل تنفيذ التجربة.
   3. للمساعدة في تقليل السمية الضوئية والتبييض الضوئي أثناء التصوير السريع (time-lapse)، قلل عدد مجموعات Z واختر منتصف المستوى من الخلايا لالتقاط الصورة.
6. اختر مجموعة المرشح المناسبة للتجربة باستخدام التصميم ثم تبويب القنوات في مربع حوار التصميم/التشغيل (TRITC: EX 542/27؛ EM 597/45؛ FITC/GFP: EX 475/28؛ EM 525/48; mCherry: EX 575/25; EM 632/60؛ Cy5: EX 632/22؛ EM 676/34).
   1. أيضا، اختر مرجعا لجمع معلومات POL/DIC. ضبط نسبة الانتقال (شدة الضوء) ومدة التعريض للقنوات الفردية المختارة قبل التصوير باختيار الخيارات المناسبة في مربع حوار resolve3D .
      ملاحظة: في مجال رؤية اختبار غير مأخوذ في التجربة، اختبر هذه الإعدادات لتحديد ما إذا كانت المعلمات المختارة تحصل على بيانات فلورية ذات معنى دون فقدان إشارة ضعيفة أو تشبعها بشكل مفرط. ثم تستورد هذه المعاملات لإعداد التجربة.
7. افتح قائمة النقاط باختيار زر قائمة النقاط في مربع حوار resolve3D . يجب أن يظهر مربع حوار جديد بعنوان قائمة النقاط. حدد عدة مجالات رؤية لاستخدامها في التجربة عن طريق إيجاد مجالات رؤية مناسبة باستخدام ضوابط مرحلة المجهر واختيار خيار تحديد النقطة في مربع حوار قائمة النقاط.
   ملاحظة: يجب اختيار نقطة استبدال في كل مرة يعاد فيها تركيز المجهر على نقطة في قائمة النقاط. يمكن القيام بذلك عن طريق تركيز المجهر على النقطة المناسبة في القائمة ثم اختيار زر نقطة الاستبدال . من المهم عدم لمس مقبض الضبط التناظري الخشن/الدقيق عند إعادة التركيز؛ استخدم فقط البرنامج لضبط التركيز.
8. حدد معلمات التايم لابس أولا باختيار التصميم ثم تبويب التايم لابس في مربع حوار التصميم/التجربة. اختر مربع تحديد التايم لابس. أدخل معلمات الزمن المؤقت المناسبة من حيث صور التايم لابس/الوقت الكلي.
9. حدد النقاط التي يتم تصويرها من قائمة النقاط أولا عن طريق اختيار علامة التصميم ثم تبويب النقاط في مربع حوار التصميم/التجربة التشغيلية. اختر خيار قائمة نقاط الزيارة وأدخل نقاطا ليتم تصويرها في مربع النص المفصولة بفواصل أو شرطات إذا كان التسلسل كاملا.
10. قبل بدء التجربة، قم بتحرير أسماء الملفات ومواقع الملفات باستخدام تبويب التشغيل في مربع حوار التصميم/التشغيل. يمكن تغيير موقع الملف باختيار زر الإعدادات ، ثم اختيار مجلد البيانات، ثم اختيار المجلد المناسب أو إنشاء مجلد جديد. غير أسماء الملفات بإدخال اسم الملف الجديد في مربع نص اسم ملف الصورة.
11. ابدأ التجربة باختيار زر التشغيل في مربع حوار بدء التجربة .
    ملاحظة: بالنسبة للمرور الزمني، تحقق باستمرار من التركيز في كل مجال رؤية طوال التجربة باستخدام إعداد DIC (لتجنب التبييض الضوئي غير الضروري) وأعد التركيز وتحديث المعلومات في قائمة النقاط لأن الخلايا تميل إلى الخروج عن التركيز مع مرور الوقت.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغاروز	كواشف فيشر الحيوية	BP160-100	درجة علم الأحياء الجزيئي - معدل تقوية الأثر المنخفض
FM4-64	إنفيتروجين	T3166	المجهر
طبق زجاجي قاع	ماتيك	P35G-1.5-14-C	المجهر
المجهر	GE	دلتا فيجن إيليت	حامل مجهر معكوس مخصص من نوع أوليمبوس IX-71؛ برج إضاءة مخصص ووحدة إضاءة مرسلة. الأهداف: بلابون 60X (1.42 م، WD 0.15 مم); OLY 100X OIL (N.A. 1.4، WD 0.12 مم)؛ منشور DIC Nomarski لهدف 100X؛ كاميرا CoolSnap HQ2؛ SSI تجميع 7 ألوان؛ غرفة التحكم البيئي - معتمة.
PC190723	ميليبورسيغما	3445805MG	مثبط FtsZ
سوفت ووركس	GE		برامج التصوير الموردة من الشركة المصنعة