$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
1. تلقيح ليستيريا مونوسيتوجينات في الفئران عبر حقن وريد الذيل وتقييم العبء البكتيري داخل الكبد والطحال والقلب
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع أعمال الحيوانات وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية من المستوى 2 التابعة لمراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC). عادة ما يتم طلب الفئران قبل أسبوع واحد ويتم وضعها في أقفاص مع 5 حيوانات في كل قفص. يسمح للفئران بالتكيف مع بيئة المختبر الجديدة لمدة أربعة أيام قبل الحقن. استخدمت هذه التجارب أنثى فئران سويسرية ويبستر تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع، تم وضعها 5 في قفص في بيئة حاجزة وتم إطعامهن بنظام غذائي غير مقيد.
- جهز قفص واحد من الفئران في كل مرة عن طريق إزالة الغطاء وصناديق الطعام/الماء، ووضع القفص تحت مصباح تدفئة لمدة خمس دقائق. تسمح هذه العملية بتوسيع الأوردة الذيلية، مما يسهل تنفيذ الحقن.
- قم بإزالة حيوان واحد وضعه في حزام (أو أنبوب صقر مع قطع نهايته) لتقييد الحيوان أثناء الحقن.
- نظف موقع الحقن باستخدام وسادة كحولية، ودع الكحول يتبخر. هذا لا ينظف الموقع فقط، بل يوسع وريد الذيل أيضا.
- باستخدام حقنة بسعة 1 مل مزودة بإبرة قياس 27.5، حقن الفأر بلطف ب 200 ميكرولتر من الزراعة المطلوبة في وريد الذيل.
- استخدم شاشا لإيقاف أي نزيف قد يحدث نتيجة الحقن، وضع الحيوان في قفص جديد.
- كرر هذه العملية للحيوانات والسلالات المتبقية. تأكد من وضع علامة على كل قفص من الحيوانات بالسلالة التي تلقاها.
- راقب الحيوانات يوميا، وإزالة وتقديم أي حيوانات تبدو مريضة. إذا لم تظهر على أي حيوان علامات مرض، دع العدوى تستمر لمدة 72 ساعة قبل التضحية بجميع الحيوانات.
- للتضحية،استخدم تخدير ثاني أكسيد الكربون من مصدر معبأ حتى تتوقف جميع التنفسات، ثم استخدم خلع عنق الرحم لضمان موت الحيوان.
- بعد التضحية، انقل الحيوانات إلى غطاء زراعة الأنسجة للتشريح.
- باستخدام كتلة تشريح، ثبت كل ساق من الحيوان بإبر كبيرة ورش الحيوان بنسبة 70٪ إيثانول حتى يتشبع.
- اقطع جلد البطن والصدر باستخدام شق على شكل حرف Y يمتد من فتحة المهبل إلى عملية الزيفويد، ثم يتقدم إلى إبط كل ذراع.
- اسحب الجلد للخلف وأزل الإبر من كل ساق لإبقاء التشريح مفتوحا.
- اقطع بلطف عبر الصفاق، كاشفا الأمعاء والمعدة والكبد والطحال.
- عن طريق قطع الوريد الكبدي والرباط الإكليفي في أعلى الكبد، ابدأ بإزالة الكبد. توجد أربطة إضافية يجب إزالتها تحت الكبد، تربطه بالجزء الأول من الأمعاء الدقيقة، وكذلك بعضلات الظهر.
- ضع الكبد في 5 مل من DDH20 المعقم في أنبوب صقر بحجم 50 مل.
- بعد ذلك، قم بإزالة الطحال عن طريق عزله وقطع الأوعية الدموية والأربطة بلطف. سيتم إزالة الطحال بسهولة أكبر من الكبد. ضع الطحال في أنبوب صقر منفصل يحتوي على 5 مل معقم ddH20.
- حدد موقع الحجاب الحاجز واقطع بلطف على طول القفص الصدري لرؤية الصدر. اقطع النتوء الزيفوئيد وعظمة القص إلى مستوى الرقبة لفتح الصدر، مما يكشف القلب والرئتين.
- باستخدام الملقط، أمسك القلب برفق من قمته وارفعه بحيث تكون الشريان الأبهر والأوعية الرئوية في حالة توتر. اقطع هذه الأوعية لتحرير القلب.
- ضع القلب في أنبوب صقر بسعة 50 مل يحتوي على 5 مل من DDH20 المعقم.
- تخلص من جثة الفأر، وكرر هذه العملية لكل حيوان، باستخدام أنابيب صقر نظيفة تحتوي على 5 مل من DDH20 معقمة لكل عضو يتم إزالته.
- بعد إزالة جميع الأعضاء، نظف محطة العمل وارجع إلى المقعد.
- جهز مجموعة من 5 أنابيب لاستخدامها لتنظيف وتعقيم الموزع لكل مجموعة من الأعضاء من خمسة فئران (أي مجموعة 5 أنابيب ل5 كبد، 5 أنابيب ل5 طحال، و5 أنابيب ل5 قلوب). يجب ملء أربعة من كل أنبوب ب 30 مل معقم ddH20، وواحد واحد ب 30 مل 90٪ EtOH.
- باستخدام جهاز TissueMaster (أو معادل مكافئ)، يغمس الموزع (أثناء التشغيل) في الأنابيب المحضرة في الخطوة 1.21 كما يلي لتنظيف المجس:
- أنبوب 1 (ddH2O) 5 ثوان في أنبوب 2 (ddH2O) 5 ثوان في أنبوب 3 (EtOH) 5 ثوان في أنبوب 4 (ddH2O) 5 ثوان في أنبوب 5 (ddH2O)
- قم بتجانس أحد الكبد باستخدام الماكينة لمدة لا تقل عن دقيقتين، أو حتى لا يبقى أي أجزاء مرئية من العضو. استخدم الملقط لإزالة أي حطام كبير من المجس.
- كرر عملية التنظيف الموصوفة.
- كرر عملية التجانس للكبد الأخرى، مع التأكد من غسل المجس بين كل كبد باستخدام العملية الموصوفة.
- بعد أن تتجانس جميع الكبد تماما، تخلص من أنابيب الغسيل (1-5) للكبد.
- كرر عملية التجانس/التنظيف لكل من الطحال والقلب أيضا، مع التأكد من استخدام مجموعة جديدة من أنابيب الغسيل لكل سلسلة من الأعضاء. إذا أصبحت أنابيب الغسيل عكرة في أي وقت، تخلص منها واستبدلها بأنابيب جديدة لإنهاء السلسلة.
- بعد أن يتم تجانس جميع الأعضاء، قم بدورة تنظيف أخيرة على المعالج وجففه جيدا للتخزين.
- ضع حوالي 200 ميكرولتر من كل عضو في بئر فردي من صفيحة مكونة من 96 بئرا.
- قم بتخفيفات متسلسلة على عينات الأعضاء عن طريق تخفيف بنسبة 1:10 في سلسلة تصل إلى تخفيفات بنسبة 1:10,000 (الكبد والطحال) أو حتى تخفيفات بنسبة 1:1,000 (القلب).
- ضع لوحة موضعية لسلسلة التخفيف على أجار LB المسخن مسبقا. كما أزل 20 وحدة من كل عضو ولوحة غير مخففة على صفائح أجار منفصلة من LB لتعداد ال CFU من الأعضاء التي لم تستعمر جيدا.
- تخلص من أنابيب الصقر التي تحتوي على الأعضاء المتجانسة، ولف ألواح 96 بئر تحتوي على سلسلة التخفيف بطبقة بارا فيلم وضعها في صندوق تجميد عند -80 درجة مئوية.
- دع البقع تجف. يتم تسريع هذه العملية بوضع الألواح في غطاء المحرك وإزالة الأغطية.
- بعد أن تجف البقع، ضع الألواح في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
- عد عدد المستعمرات في كل نقطة في صباح اليوم التالي واستخدم سلسلة التخفيف لحساب العدد الكلي للبكتيريا في كل عضو.