$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوانات المختصة.
1. العدوى
- احصل على فئران BALB/c من كلا الجنسين بين عمر 10-12 أسبوعا.
ملاحظة: السلالة النوعية الرابعة من المكورات الرئوية العقدية TIGR4 هي عزل سريري قوي تم تسلسله. - ازرع TIGR4 في مرق تود-هيويت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى تصل إلى كثافة بصرية (OD)620 مقدارها 0.5 (ما يعادل 1.0 ×10 وحدات تشكيل مستعمرات 8 [CFU]/ml). قم بإزالة الحبوب من مزرعة المكورات الرئوية عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 3,500 x جرام وإزالة المادة الفائقة باستخدام خط تفريغ. تعليق وتخفيف البكتيريا باستخدام محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي يبلغ 1.0 × 104 وحدة CFU/ml.
- باستخدام غرفة الحث، قم بتخدير الفئران التي تحتوي على 2.5٪ من الإيزوفلوران المتبخر في الأكسجين. أكد حالة التخدير عن طريق قرص خفيف على إصبع القدم باستخدام ملقط غير حاد.
- عند إمساك الفأر المخدر من مؤخرته ووضعه القائم بيد واحدة، حقن كل فأر داخل الصفاق (i.p.) ب 100 ميكرولتر من تعليق S. pneumoniae باستخدام حقنة بإبرة قياس 27-30 (تتوافق مع جرعة تحدي 1.0 ×10 3 وحدة CFU). أعد الفأر إلى قفصه. عادة ما تستيقظ الفئران بعد 30-40 ثانية من الحقن.
- دع العدوى تستمر لمدة لا تقل عن 24 ساعة (مبكرة) أو 30 ساعة (متقدمة).
- قتل الفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء خلع عنق الرحم لضمان وفاة الفأر. يتم تأكيد القتل الرحيم أكثر بإزالة القلب في الخطوة 1.6.
- عقم الذيل بمسحة كحولية واقص جزءا بحجم 2-3 مم. اجمع 2 ميكرولتر من الدم وقم بتخفيف الدم بشكل تسلسلي 10 مرات في PBS يحتوي على هيبارين الصوديوم 1 U/ml خمس مرات. يتم تخفيف الألواح بشكل متسلسل على صفيحة أجار دم الصويا التريبتيكية وتحتضن طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، يتم استنتاج مستوى بكتيريميا من المستعمرة.
- ثبت الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر على منصة جراحية. رش الصدر بنسبة 70٪ إيثانول وتجفيف بالربطة. باستخدام المقص الجراحي والملاقط، افتح تجويف الصدر، وأزل القفص الصدري، واقطع الحجاب الحاجز لكشف القلب والرئتين. باستخدام المقص، اقطع الأوعية الدموية المتصلة بالقلب واقطع القلب بلطف بحذر لتجنب الكدمات بالملاقط.
- شطف القلب ب PBS ثم وضعه في أشرطة جمع عينات الأنسجة بحيث يتم إجراء مقاطع تاجية أثناء تقطيع الأنسجة. لتضمين البارافين، ضع الأشرطة في محلول فورمالين مخزن 10٪، وفي اليوم التالي أرسل طلبا لتضمين البارافين.
- بدلا من ذلك، يتم تجميد القطع الفوري باستخدام مركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) داخل مولد تجميد تم وضعه على الثلج الجاف.
2. تصور آفات القلب والمكورات الرئوية داخل الآفات
- قم بقص أقسام القلب المدمجة بالبارافين بحيث تكون الغرف الأربع للقلب مرئية في كل قسم نسيج. الشرائح المقطوعة بسماكة 5 ميكرومتر.
- إزالة البارافينين وصبغ السلايدات بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) باستخدام الطرق القياسية.
- عرض مقاطع القلب المصبوغة ب H&E باستخدام مجهر ضوئي بتكبيرات منخفضة (100X، 200X) وعالية (الغمر بالزيت: 400X، 1,000X). توصيف القلوب لوجود آفات دقيقة في عضلة القلب. هنا، التقط صورا من H&E باستخدام مجهر Zeiss Axioskop 2 المزود بهدف عدسة عدسة رقمية 100X 1.3 من نوع Plan-NEOFLUAR.
ملاحظة: في المراحل المبكرة، تميز آفات القلب بسبب اختلاف لونها وفي بعض الحالات وجود خلايا مناعية (وحيدة وحبيبية)، والتي تبدو كخلايا وحيدة. في الآفات المتقدمة، خصوصا تلك التي تظهر بعد 30 ساعة، تكون خلايا المناعة غائبة، وتلاحظ آفات كبيرة تشبه الفجوات في مكانها. من المهم ملاحظة أنه رغم أن تدفق الخلايا المناعية يمكن أن يحدث خلال المراحل المبكرة من تطور آفات القلب، إلا أنه لا يبدو أنه شرط.