$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بعينات الحيوانات والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوانات المختصة.
1. العدوى
- احصل على فئران BALB/c من كلا الجنسين بين عمر 10-12 أسبوعا.
ملاحظة: السلالة المصلية TIGR4 من نوع Streptococcus pneumoniae هو عزل سريري قوي تم تسلسله. - ازرع TIGR4 في مرق تود-هيويت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى تصل الثقافة إلى كثافة بصرية عند 620 نانومتر (OD 620) مقدارها 0.5 (ما يعادل 1.0 × 10وحدات تكوين مستعمرات [CFU]/ml). قم بإزالة الحبوب في زراعة المكورات الرئوية بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 3,500 × جرام وإزالة المادة الفائقة باستخدام خط تفريغ. تعليق وتخفيف البكتيريا باستخدام محلول ملحي معقم بفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي 1.0 × 104 وحدة CFU/ml.
- باستخدام غرفة الحث، قم بتخدير الفئران التي تحتوي على 2.5٪ من الإيزوفلوران المتبخر في الأكسجين. أكد حالة التخدير عن طريق قرص خفيف على إصبع القدم باستخدام ملقط غير حاد.
- عند إمساك الفأر المخدر من مؤخرته ووضعه بشكل مستقيم بيد واحدة، حقن كل فأر داخل الصفاق (i.p.) ب 100 ميكرولتر من تعليق S. pneumoniae باستخدام حقنة بإبرة قياس 27-30 (تتوافق مع جرعة تحدي 1.0 × 103 وحدة قدم مكشوفة). أعد الفأر إلى قفصه. عادة ما تستيقظ الفئران بعد 30-40 ثانية من الحقن.
- دع العدوى تستمر لمدة لا تقل عن 24 ساعة (مبكرة) أو 30 ساعة (متقدمة).
- قتل الفئران بالاختناق بثاني أكسيد الكربون. قم بإجراء خلع عنق الرحم لضمان وفاة الفأر. يتم تأكيد القتل الرحيم أكثر بإزالة القلب في الخطوة 1.6.
- عقم الذيل بمسحة كحولية واقص جزءا بحجم 2-3 مم. اجمع 2 ميكرولتر من الدم وقم بتخفيف الدم بشكل تسلسلي 10 مرات في PBS يحتوي على هيبارين الصوديوم 1 U/ml خمس مرات. يتم تخفيف الألواح بشكل متسلسل على صفيحة أجار دم الصويا التريبتيكية وتحتضن طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، يتم استنتاج مستوى بكتيريميا من المستعمرة.
- ثبت الفأر في وضعية الاستلقاء على الظهر على منصة جراحية. رش الصدر بنسبة 70٪ إيثانول وتجفيف بالربطة. باستخدام المقص الجراحي والملاقط، افتح تجويف الصدر، وأزل القفص الصدري، واقطع الحجاب الحاجز لكشف القلب والرئتين. باستخدام المقص، اقطع الأوعية الدموية المتصلة بالقلب واقطع القلب بلطف بحذر لتجنب الكدمات بالملاقط.
- شطف القلب ب PBS ثم وضعه في أشرطة جمع عينات الأنسجة بحيث يتم إجراء مقاطع تاجية أثناء تقطيع الأنسجة. لتضمين البارافين، ضع الأشرطة في محلول فورمالين مخزن 10٪، وفي اليوم التالي أرسل طلبا لتضمين البارافين.
- بدلا من ذلك، يمكن تجميد القطع السريع باستخدام درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.) مركب داخل جليد تم وضعه على الثلج الجاف.
2. تصور آفات القلب والمكورات الرئوية داخل الآفات
- قم بقص أقسام القلب المدمجة بالبارافين بحيث تكون الغرف الأربع للقلب مرئية في كل قسم نسيج. الشرائح المقطوعة بسماكة 5 ميكرومتر.
- إزالة البارافينين وصبغ السلايدات بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) باستخدام الطرق القياسية.
- عرض مقاطع القلب المصبوغة ب H&E باستخدام مجهر ضوئي بتكبير منخفض (100×، 200×) وعالي (الغمر بالزيت: 400×، 1000×). توصيف القلوب لوجود آفات دقيقة في عضلة القلب. هنا، التقط صورا H&E باستخدام مجهر Zeiss Axioskop 2 المزود بهدف Plan-NEOFLUAR بفتحة عدسة 100× 1.3.
ملاحظة: في المراحل المبكرة، تميز آفات القلب من خلال اختلاف لونها وفي بعض الحالات وجود خلايا مناعية (وحيدات وحبيبية)، والتي تبدو كخلايا وحيدة. في الآفات المتقدمة، خصوصا تلك التي تظهر بعد 30 ساعة، تكون خلايا المناعة غائبة، وتلاحظ آفات كبيرة تشبه الفجوات في مكانها. من المهم ملاحظة أنه رغم أن تدفق الخلايا المناعية يمكن أن يحدث خلال المراحل المبكرة من تطور آفات القلب، إلا أنه لا يبدو أنه شرط.
3. المجهر المناعي الفلوري للاسترواح داخل الآفات الدقيقة
- قسم القلب في قوالب تجميد بميكروتوم بسماكة 5 ميكرومتر ووضع المقاطع على شرائح زجاجية موجبة الشحنة. اترك أجزاء القلب المجمدة تذوب وتجفف في الهواء. ثبت الأقسام لمدة 10 دقائق في فورمالين مخزن 10٪ محايد (درجة حموضة 6.8-7.2 عند 25 درجة مئوية).
- اغسل شرائح (3×) في PBS لمدة 5 دقائق، ثم اغسل النفاذ لمدة 15 دقيقة في ترايتون X-100 بنسبة 0.2٪ في PBS، ثم اغسل مرة أخرى ب PBS.
- قم بحجب قسم الأنسجة على الشرائح باستخدام 10٪ مصل الماعز في PBS لمدة ساعة واحدة.
- شطف شرائح ب PBS، غطى، وحضن أقسام القلب باستخدام مضاد المكورات الرئوية 4 من نوع الأرنب عند 1:1,000 في PBS مع 10٪ مصل ماعز لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: بالنسبة للضبطات السلبية، يجب على الباحثين استخدام مضاد الأرنب الساذج - بعد الغسل ب PBS، غط وحضن الأقسام بمصل الماعز بنسبة 10٪ - PBS مع الأجسام المضادة المتقاربة مضادة للأرانب فلوريسيين إيزوثيوسيانات (FITC) عند 1:2,000 لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، استخدم DAPI (4',6- دياميدينو-2-فينيليندول) بتركيز 5 ملغ/مل لتصوير النوى حقيقية النواة. اغسل وركب أقسام الأنسجة باستخدام FluorSave.
- التقاط صور فلورية باستخدام نظام المجهر الكونفوكالي بتكبير منخفض وعالي على حد سواء. قم بضبط الفتحة الرقمية وفقا لذلك للحصول على أفضل نتائج. هنا، احصل على صور فلورية باستخدام نظام كونفوكال بهدف فتحة رقمية 60× 1.42.