اختبار سريع قائم على الصور لفحص الضراوة البكتيرية الناتجة عن السطح

الملخص

المصدر: بيرينبام، ك.، وسيريابورن، أ. اختبار سريع للضراوة البكتيرية يعتمد على الصور باستخدام الأميبا. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة سريعة قائمة على الصور لتقييم ضراوة البكتيريا عن طريق حضانة الأميبات مع بكتيريا سطحية أو عوالقية، وتطبيق وسادة أغاروز من إستر كالسيتين-أسيتوكسي ميثيل (كالسيين-AM)، وتصوير الفلورة للكشف عن تلف خلايا المضيف.

البروتوكول

1. المجهر - تحضير وسادة الأجار

1. حضر وسادات الأجار لمدة تتراوح بين 30 دقيقة إلى ساعة قبل أن تكون الأميبات جاهزة للخلط مع Pseudomonas aeruginosa.
2. ميكروويف 50 مل من 1٪ أجار (مع الجهد والجهد) في مخزن التطوير (DB) في قارورة بسعة 250 مل. اخلط كل 20 ثانية حتى تختفي كتل الأجار.
3. برد الأجار المنصهر بوضعه في حمام ماء مسخن مسبقا بدرجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. أضف 15 ميكرولتر من محلول مخزن الكالساين-AM إلى 15 مل من الأجار المنصهر في أنبوب مخروطي. اخلط بعكس الأنبوب بلطف 4 إلى 5 مرات، ثم انتقل فورا إلى الخطوة التالية.
   ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوة في أنبوب طرد مركزي بولي بروبيلين بسعة 15 مل. لا تستخدم وعاء زجاجي سميك، لأن ذلك سيؤدي إلى تصلب الأجار بسرعة كبيرة.
5. صب خليط الأجار المنصهر فوق لوح زجاجي بحجم 12 سم × 10 سم ودع الأجار ليتصلب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اقطع وسادة الأجار المتصلبة إلى أقسام أصغر بحجم 1.5 سم × 1.5 سم عن طريق وضع اللوحة الزجاجية فوق شبكة مطبوعة وقطع الشبكة باستخدام مسطرة معدنية.
6. حافظ على ترطيب الجل في صندوق رطب حتى يصبح جاهزا للاستخدام.

2. المجهر - تحضير عينة البكتيريا-الأميبا للتصوير

1. لقياس ضراوة الخلايا البكتيرية المثبتة على السطح، أضف 10 ميكرولتر من خلايا الأميبا إلى البكتيريا المتصلة على السطح.
   ملاحظة: تصف هذه الخطوة اختلاط الأميبات بالبكتيريا.
2. لقياس ضرابة الخلايا العوالقة، اخلط 10 ميكرولتر من خلايا الأميبا مع 10 ميكرولتر من البكتيريا العوالقة.
   ملاحظة: لا تغسل خلايا الأميبا الناتجة عن المحور (عند جرعة أوفرائية₆₀₀ من 0.2 إلى 0.5) قبل اختلاطها مع البكتيريا. لن يلاحظ نمو للإشريكية القولونية في مزرعة الأميبا بسبب استخدام المحلول المضاد الحيوي-المضاد للفطريات.
3. ضع فورا وسادة الأجار الكالسينية وAM، بحجم 1.5 سم × 1.5 سم من الخطوة 1.5 فوق خليط البكتيريا-الأميبا على سطح طبق بيتري.
   ملاحظة: ضع وسادة الأجار فوق الخليط بحركة سريعة وسلسة. لا تخفض الوسادة ببطء على الخليط، لأن هذه الحركة تميل إلى دفع الخلايا نحو الأطراف وبعيدا عن الجانب السفلي للوسادة. ستضمن هذه الخطوة أن تكون البكتيريا والأميبات مختلطة بشكل متساو، وتثبيت، وأن كلا النوعين من الخلايا محصوران في نفس المستوى.
4. أزل السائل الزائد عن طريق تفريغ السائل المتبقي حول وسادة الأجار بلطف بالأنبوبة. اترك طبق بتري ليجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. غط طبق بتري بغطاء وحضن خليط الأميبا-البكتيريا الثابت في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة إضافية. تابع إلى الخطوة 3.1.
   ملاحظة: من المهم حضن جميع العينات لنفس المدة الزمنية، حيث يزداد التألق الخلفي مع مرور الوقت. يوصى بفترة حضانة ساعة واحدة. الحضانة التي تستمر لأكثر من ساعة تكون أقل قابلية للتكاثر مع بدء خلايا الأميبات في الانفجار.

3. المجهر - الحصول على الصور

1. صور الأميبات باستخدام مجهر فلوري قادر على التقاط صور فلورية في الحقول الساطعة والخضراء. للفلورة الخضراء، استخدم مرشحات بروتين الفلورة الخضراء (GFP) بتركيز 474/27 نانومتر و525/45 نانومتر للإثارة والانبعاث على التوالي. استخدم هدفا بحجم 10X (فتحة عدسة رقمية ≥0.3) لتصوير الأميبا.
   ملاحظة: الكالسيين-AM في الأجار سيتسبب في توهج الأميبات المحتضرة في قناة الفلورة الخضراء. الأميبات الصحية ليست فلورية بخلاف ذلك.
2. قم بضبط أوقات الالتقاط لتباين الطور، وقنوات GFP للحد من السمية الضوئية وتحسين النطاق الديناميكي لشدة الصورة. استبدل تباين طور التداخل التفاضلي (DIC) إذا لزم الأمر.
   ملاحظة: استخدم تعريضات تتراوح بين 100 - 200 مللي ثانية للتباين الطوري وتوهج GFP إذا أمكن. حافظ على التعريض وإعدادات الآلات دون تغيير طوال التجربة بأكملها. وهذا أمر حاسم لحساب مؤشر قتل المضيف.
3. احصل على صور لما لا يقل عن 100 خلية أميبا للحصول على إحصائيات جيدة لحساب مؤشر قتل المضيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المواد الكيميائية
باكتو آجار، مجفف	بي دي ديفكو	214010
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X)	تقنيات الحياة	15240062	< Aliquot 1 مل ويخزن عند -20 درجة مئوية
إستر كالسيين-أسيتوكسي ميثيل (كالسيين-AM)	تقنيات الحياة	C34852	كالسيين أسيتوكسي ميثيل (AM)
كلوريد الكالسيوم، لا مائي	سيغما-ألدرتش	C1016
دي-جلوكوز	فيشر كيميكال	D16500	ديكستروز
ثنائي ميثيل كبريتات	سيغما-ألدرتش	D5879
حمض الفوليك	سيغما-ألدرتش	F8758
LB-ميلر	بي دي ديفكو	244620
كلوريد المغنيسيوم	سيغما-ألدرتش	M8266
مستخلص الخميرة	أكسويد	LP0021
بيبتون خاص	أكسويد	LP0072
هيدروكسيد البوتاسيوم	فيشر كيميكال	P250
فوسفات البوتاسيوم أحادي الأساس	سيغما-ألدرتش	P0662
فوسفات الصوديوم ثنائي البازي هيبتاهيدرات	فيشر كيميكال	S373
فيتامين ب12	سيغما-ألدرتش	V2876
السلالات
ديكيوستيليوم ديسكويديوم	مختبر سيريابورن	سلالة AX318
الإشريكية القولونية	مختبر سيريابورن	السلالة B/r17
سودوموناس إيروجينوزا	مختبر سيريابورن	PA14	سلالة PA14 19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	مختبر سيريابورن	AFS20.1	السلالة المشتقة من PA1420
الإمدادات
مرشح 0.22 ميكرومتر	ميليبور	SCGPT01RE	لتعقيم المرشح
أنبوب مخروطي، 15 مل	كورنينغ	352097
زجاجات التخزين الزجاجية	بايركس	13951L	250 مل، 500 مل، 1000 مل
طبق بتري، قطر 6 سم	كورنينغ	351007	ألواح البوليسترين بحجم 60 × 15 مم
طبق بتري، قطر 10 سم	فيشر	FB0875712	ألواح البوليسترين 100 × 15 مم
حاويات بلاستيكية بغطاء	زيبلوك	2.57E+09	حاويات مربعة بسعة 3 أكواب
الألواح الزجاجية	بيو-راد	1653308	لتحضير فوط الأجار. قد تستخدم ألواح زجاجية أخرى بأبعاد مماثلة.
عصي خشبية	فيشر	23-400-102
المعدات
مجهر إكليبس Ti-E	نيكون	MEA53100	إعداد المجهر
خطة 10X فلور ph1 هدف 0.3 NA	نيكون	MRH20101	إعداد المجهر
مصدر إثارة الفلورة	لومينكور	محرك سولا الخفيف	إعداد المجهر
مجموعة مرشحات الفلورة	سيمروك	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	إعداد المجهر
كاميرا Orca Flash 4.0 V2	هاماماتسو	77054098	إعداد المجهر
ImageJ	المعاهد الوطنية للصحة	المجلد 1.49	برامج تحليل الصور
ماتلاب	ماث ووركس	R2013	برامج تحليل الصور
حاضنة الهزاز المداري	VWR	89032-092	لنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية
هز المنصة	فيشر	13-687-700	لنمو الأميبا عند 22 درجة مئوية
مقياس الطيف الفوتوني	بيوكروم	ألتروسبيك 10
حاضنة مبردة تحت الطاولة	فيشر	97990E	لنمو الأميبا عند 22 درجة مئوية
حمام مائي متساوي الحرارة	فيشر	15-462-21Q	لوسائط التبريد حتى 55 درجة مئوية