تقييم العبء البكتيري في طحال الفأر لدراسات العدوى

الملخص

المصدر: مادنسباتشر، ج. ه. وفيسلر، م. ب. طريقة غير جراحية وغير مكثفة تقنيا لتحفيز وتصوير الالتهاب الرئوي البكتيري التجريبي في الفئران. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو عملية قياس الحمل البكتيري في طحال فأر مصاب لتقييم شدة العدوى. يتم تخفيف الطحال المتجانس بشكل متسلسل وطلائه لتحديد العبء البكتيري الكلي. توفر البيانات الناتجة رؤى حول تفاعلات المضيف والممرض داخل الأنسجة الجهازية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. شفط الكلبسيلا الرئوي من الفرسان داخل القصبة الهوائية من الفم الفموي

1. تأكد من أن الفئران محددة بشكل فريد من خلال علامة الذيل أو الوشم أو أي معرف معتمد آخر.
2. قم بتحضير جرعة من البكتيريا باستخدام ماصة P200 قبل إزالة الفئران من الإيزوفلوران لتسريع الإجراء. للحصول على أفضل النتائج مع شفط التقنية الاصطناعية، استخدم حجم <100 ميكرولتر لمنع التدفق. هنا، استخدم 2000 وحدة تشكيل مستعمرات (CFU)/50 ميكرولتر من K. pneumoniae.
3. تخدير الفئران في غرفة شفافة باستخدام غاز الإيزوفلوران (مثل 2٪ إيزوفلوران بمعدل تدفق 1 لتر/دقيقة) أو وفقا لإرشادات المؤسسات. عدد الفئران التي يجب تخديرها معا يحدد حسب مستوى راحة المجرب، عادة 1-2 في كل مرة. راقب التنفس وتأكد من مستوى التخدير بمجرد رؤية التنفس العميق ويمكن عد 2-3 ثوان بين الأنفاس. ملاحظة: إذا كان هناك قلق بشأن التأثيرات المربكة المحتملة للتخدير المتطاير (المستنشاق)، يمكن تحقيق التخدير بدلا من ذلك بحقن الكيتامين/زيلازين داخل الصفاق. بالطريقة الموضحة أعلاه، يستمر التخدير العميق لبضع دقائق فقط. إذا تم تحفيز تخدير طويل الأمد، يجب استخدام مرهم العين لمنع جفاف العين.
4. بعد تخدير الفأر، وضعه في وضعية شبه مستلقية على ظهره، معلقا بواسطة قواطع الفك العلوي من شريط مطاطي ممتد بين المسامير على لوح بلاكسيجلاس مائل (الشكل 1).
5. اسحب لسان الفأر بلطف إلى الجانب باستخدام ملقط غير متجدب ووضع الجرعة في تجويف الفم باستخدام ماصحة P200. كن حذرا للغاية لتجنب إحداث إصابات في اللسان أو البلعوم الفموية.
6. مع إبقاء اللسان مسحوبا، أغلق الأنف بلطف بإصبع مرتدي قفاز حتى يستنشق الفأر. استمر في تغطية الأنف حتى يأخذ الفأر استنشاقين أو أكثر، ولا يظهر سائل في تجويف الفم. تغطية الأنف تساعد في ضمان استنشاق البكتيريا في الرئتين، حيث أن الفئران تتنفس الأنف بشكل إلزامي.
7. أخرج الفأر من لوح التطعيم وأعد إلى قفصه، وضعه على ظهره لمنع الفراش أو الحطام من سد الفتحات أثناء تعافيه من التخدير.
8. بمجرد أن يتم تناول جميع الفئران واستيقاظها من التخدير، تقيم الفئران في غرفة أو مكتب تحتوي فقط على فئران تم إعطاؤها جرعة من K. pneumoniae. راقب الفئران يوميا، بما في ذلك أوزان الجسم، إذا تجاوز 48 ساعة بعد العدوى.
9. استخدم الهرس اليومي و/أو الحرارة الإضافية إذا تركت الفئران تتجاوز 48 ساعة.

2. تحديد الحمل البكتيري في الأنسجة الرئية والطرفية

1. قبل البدء: حضر أنابيب تخفيف تحتوي على 900 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x للرئة والطحال و90 ميكرولتر من 1x PBS للدم. ألواح ملصقات لزراعة البكتيريا ووضعها في درجة حرارة الغرفة؛ لذلك، بمجرد جمع الأنسجة، يتم تقليل الوقت بين التجانس وتغطية الطلاء لنمو البكتيريا.
   ملاحظة: نظرا لترسب البكتيريا غير المتجانس في الرئتين الذي يمكن أن يحدث مع الشفط، يوصى باستخدام الفئران الفردية لتحليل إما النسيج الخلوي الكلي في مجرى الهواء أو العبء الكلي (ثنائي الجانب) للبكتيريا في الرئة.
2. قتل الفئران حسب إرشادات المؤسسات. هنا، استخدم حقنة قاتلة بجرعة 150 ملغ/كغ من بنتوباربيتال الصوديوم أو جرعة مكافئة من محلول القتل الرحيم التجاري، تليها نزيف الدم، حيث يتجنب ذلك المضاعفات المحتملة للرئتين المرتبطة باستنشاق_ثاني أكسيد الكربون وانخلاع عنق الرحم.
3. أزل الطحال وضعه في 2 مل من 1x PBS. ضع الأنابيب على الثلج. احرص على تنظيف الأدوات بالإيثانول بين كل منديل أو فأرة.
4. توحيد النسيج على الثلج، ويفضل باستخدام مجانسات يمكن استبداله بين كل عينة. يمكن إعادة استخدام رؤوس التجانس القابلة للتخلص من التعقيم بين التجارب.
5. بمجرد أن يتم توحيد الأنسجة، قم بإجراء تخفيفات متسلسلة واستخدام الطبق. عينات من الألواح من أنسجة/تخفيف معين مكررة على لوح أجار الصويا التريبتيكي (TSA) واحد عن طريق رسم خط فاصل على البلاستيك. توضح اقتراحات الطلاء والتخفيف أدناه (في جميع الحالات، يتم نشر 10 ميكرولتر من العينة على اللوحة) وتعتمد على تشريح بعد 24 ساعة من العدوى. عند تحليل عينات من 48-72 ساعة، قد تحتاج كمية أكبر من التخفيفات إلى طلاء بسبب زيادة عبء البكتيريا في أوقات لاحقة
   1. بالنسبة للطحال - قم بتخفيف 1:10-1:100 بإضافة 100 ميكرولتر من الطحال المتجانس إلى 900 ميكرولتر من PBS المعقم 1x بشكل تسلسلي. الطبق متجانس وكلا التخفيفين مكررون.
6. اترك عينات الانتشار تجف لفترة وجيزة.
7. قم بقلب ألواح TSA وضعها في حاضنة ثابتة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل.
8. حدد عدد البكتيريا المستعمرة عن طريق حساب متوسط مستعمرات البكتيريا من جانبي الصفيحة ومن كل تخفيف. ضع في الاعتبار التخفيفات الأولية 5 مل للرئة و2 مل للطحال لتحديد إجمالي الوحدات الخالية من النسيج الكامل.

النتائج

الشكل 1: لوحة الإجراءات للالتهاب الرئوي الشمقي في الفئران. توضع فئران الدراسة برأس للأعلى والعودة إلى اللوح (أي نصف مستلقية)، معلقة بواسطة القواطع من شريط مطاطي ممتد بين دبابين مثبتين على لوح بلاكسي أو مشابه له.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ATCC	43816
بيكتون ديكنسون	211825
تم إعدادها داخليا	لا يوجد	ماء مقطر (5 لتر)، NaCl (40 جم)، KCl (1 جرام)، Na₂HPO₄ (5.75 جم)، KH₂PO₄ (1 جم)