تصور مستقلبات الأحماض الأمينية في أنسجة الأمعاء لدى الفئران المصابة

الملخص

المصدر: سبيكر، ج. ت. وآخرون. دراسة التعاون الميكروبي من خلال تحليل التصوير الطيفي الكتلي لمستعمرات البكتيريا التي نمت على الأجار وفي الأنسجة أثناء العدوى. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو استخدام مطيافية الكتلة بمساعدة المصفوفة بالليزر المدعوم بالمصفوفة (MALDI) لرؤية توزيع الأحماض الأمينية في أنسجة الأمعاء من فئران مصابة بكلوستريدويد ديفيسيل، بمفردها أو مع مجمع مع المكمكس المعوية الفارزية. تتضمن العملية تحضير الأنسجة، وتطبيق المصفوفة، وتأين الليزر، واكتشاف أيونات الأحماض الأمينية لتوليد صور أيونية مكانية. تكشف النتائج عن التعاون الميكروبي، حيث يغير E. faecalis بيئة الأمعاء عن طريق إفراز الأورنيثين واستنزاف الأرجينين، مما يعزز من سبب مرض C. difficile .

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تحضير وشحن أنسجة الجرذ غير المصابة والمصاب ب C. difficile
   1. قم بتلقيح الفئران الذكور C57BL/6 بمضادات حيوية (0.5 ملغ/مل سيفوبيرازون أو 0.5 ملغ/ملليتر سيفوبيرازون + 1 ملغ/مل فانكومايسين) في ماء الشرب بإرادته لمدة 5 أيام، تليها فترة تعافي لمدة يومين ثم إصابة.
   2. قم بقتل الحيوانات عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون واصطدم عضو الساق الفأر فورا. أضعه في خليط بنسبة 20٪ من مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) في ماء مقطر.
   3. ضع العينات على الثلج الجاف ثم تعبئتها وشحنها للتحليل؛ خزنها عند -80 درجة مئوية حتى التحليل.

 

2. التقميد في أنسجة الجرذ غير المصابة مقابل أنسجة الفأر المصابة ب C. difficile

1. نظف جميع معدات التقسيم بالتجميد عن طريق الشطف بالإيثانول بنسبة 100٪ واتركه لتجف قبل وضع العينات في غرفة التجميد. جهز شرائح المجهر المطلية ب ITO باستخدام أوممتر لتحديد جانب الشريحة الذي يحتوي على الطلاء الموصل. استخدم خط ذو طرف ماسي لنقش ووضع علامة على الجانب المطلي ب ITO من شريحة المجهر.
   ملاحظة: يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ونظارات المختبر، ومعطف المختبر، وأكمام التجميد الكامل.
2. قم بإجراء القطع بالتجميد على ميكروتوم بحثي. انقل نسيج السيكا المدمجة في OCT من فريزر بدرجة حرارة -80 درجة مئوية إلى غرفة الميكروتوم الكريوميكروتومية (درجة حرارة غرفة 30 °م، -28 °م) على الثلج الجاف. يتم تركيب عينات الأنسجة التي سيتم مقارنتها باستخدام مطياف الكتلة التصويرية (مثل الضابط غير المصب مقابل المصابة بعدوى الديفيسيل) على نفس شريحة المجهر لضمان تطابق العينات لكلا النوعين وتمكين مقارنات دقيقة للمستقلبات.
3. داخل غرفة الميكروتوم الكريوميكروتوم، قم بتركيب النسيج المدمج في OCT على قالب عينة باستخدام محلول OCT إضافي. بعد أن يتصلب محلول OCT، ثبت العصا على رأس العينة. ابدأ التشريح بالتجميد بزيادات 10-50 ميكرومتر للوصول إلى عمق النسيج/المستوى المطلوب للعضو.
4. بمجرد الوصول إلى المقطع العرضي الأمثل للنسيج، ابدأ بجمع المقاطع بسماكة 12 ميكرومتر. قم بتحريك الشريحة بلطف باستخدام فرش الرسم الفني وضعها على شريحة مجهرية مغطاة بالتفلون.
5. لف شريحة المجهر المغطاة ب ITO فوق قسم الأنسجة لالتقاط النسيج من الشريحة المغطاة بالتفلون. قم بتثبيت قسم الأنسجة على شريحة المجهر عن طريق الضغط على راحة اليد على ظهر شريحة المغلفة ب ITO. استمر في إذابة القاعدة حتى يتحول قسم الأنسجة من شفاف إلى ملمس معتم/غير لامع.
6. نقل شرائح المجهر المثبتة على الأنسجة على الثلج الجاف إلى صندوق جاف مع مادة مسبب للتخزين للتحليل في نفس اليوم، أو تخزينها عند -80 درجة مئوية للتخزين لفترات طويلة.

3. تحضير أنسجة العضلات غير المصابة ضد الأنسجة المخروطية المصابة بالكورديا ديفيسيل لتطبيق المصفوفة وتحليل الطيف الكتلي التصويري MALDI

1. تنفيذ تطبيق مصفوفة MALDI (درجة حرارة الفوهة 30 °م، ثماني محاولات، معدل تدفق 0.1 مل/دقيقة، نمط CC، وقت جفاف 0 ثانية، 10 psi).
2. إجراء تحليل الطيف الكتلي التصويري MALDI
3. تحليل صور الأيونات من عدة نسخ بيولوجية وقارن النتائج للدلالة عبر مقارنات مخطط صندوق الشدة باستخدام برنامج SCiLS الإحصائي المشار إليه أعلاه.
   ملاحظة: ستعتمد الاختبارات والمقارنات الإحصائية المناسبة على التطبيق ويمكن أن تشمل التقسيم المكاني، ونماذج التصنيف، والتحليل المقارن لتحديد السمات الطيفية التمييزية والمرتبطة به. يمكن أن تشمل التحليلات المقارنة تعيين قيم p للميزات ذات الدلالة، وتوليد تحليلات المكونات الرئيسية لمقارنات الأنسجة، وتصور مخططات الصندوق لتحديد التباينات. من المفيد أيضا تصور الأنسجة باستخدام مجهر الحقل المضيء لقسم النسيج المصبوغ بالهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E) بعد تصوير مطيافية الكتلة. يتيح ذلك تحديد الخصائص الشكلية في الأنسجة بوضوح ويمكن تحليله بالتشاور مع أخصائي علم أمراض مدرب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
فلاتر حقن نايلون Titan3 بحجم 0.2 ميكرومتر	ثيرمو ساينتفيك	42225-NN
مصفوفة مالدي 1,5-ديامينونفثالين	سيغما ألدريتش	2243-62-1
محاقن Henke Ject luer lock بسعة 20 مل	هينكي ساس وولف	4200.000V0
مقياس الفراغ الحراري من سلسلة 275i	شركة كورت ج. ليسكر	KJL275807LL
مطياف الكتلة 7T SolariX FTICR مزود بنظام ليزر Smartbeam II Nd:YAG MALDI (2 كيلوهرتز، 355 نانومتر)	بروكر دالتونيكس
محلول حمض الخليك، مناسب لمحلول HPLC	سيغما ألدريتش	64-19-7
الأسيتونيتريل مناسب ل HPLC، درجة التدرج، ≥99.9٪	سيغما ألدريتش	75-05-8
محلول هيدروكسيد الأمونيوم، 28٪ NH3 في H2O، ≥99.99٪ أساس المعادن النزرة	سيغما ألدريتش	1336-21-6
أكياس بيولوجية قابلة للاستخدام بالأوكلاف: 55 جالون	غراينجر	45TV10
أكياس نقل عينات خطرة بيولوجيا (8 × 8 إنش)	فيشر ساينتيفك	01-800-07
مرق حقن القلب في الدماغ	بكالوريوس العلوم الحيوية	90003-040
فئران ذكور C57BL/6	مختبرات جاكسون
ماسح الصور والوثائق CanoScan 9000F Mark II	القانون
CM 3050S بحثي في الميكروتوم البريد	لايكا بيوسيستمز
خزانة إزالة المجفف	سيغما ألدريتش	Z268135
كاتب رأس الماس، علوم المجهر الإلكتروني	فيشر ساينتيفك	50-254-51
حبيبات التجفيف الجاف للدريريت	دريرايت	21005
الإيثانول، 200 برفوف	مختبرات ديكون	2701
برنامج flexImaging	بروكر دالتونيكس
برنامج FTMSControl	بروكر دالتونيكس
مصيدة الفراغ الزجاجي	سيغما ألدريتش	Z549460
بخاخ روبوت HTX M5 TM	تقنيات HTX
شرائح المجهر المطلية بأكسيد القصدير (ITO)	دلتا تكنولوجيز	CG-81IN-S115
فلتر HEPA متناوب إلى مضخة تفريغ	لاكونكو	7386500
الميثانول، درجة HPLC	فيشر كيميكال	67-56-1
محول الشريحة MTP II	بروكر دالتونيكس	235380
مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT)	فيشر ساينتيفك	23-730-571
مبيد الأبواغ والمطهر والمنقف من نوع Peridox RTU	كونتيك	CR85335
شرائح مطبوعة بتقنية PTFE (تفلون)، علوم المجهر الإلكتروني	VWR	100488-874
مضخة تفريغ ريشة دوارة RV8	إدواردز	A65401903
شفرات الميكروتوم عالية الملف من Tissue-Tek Accu-Edge ذات الاستخدام الواحد	علوم المجهر الإلكتروني	63068-حصان
أنابيب التفريغ الشفاف	كول بالمر	EW-06414-30
زيت مضخة التفريغ فائقة الجودة 19	إدواردز	H11025011
محول الجهد المتغير	باورستات
الماء، مناسب لاستخدام HPLC	سيغما ألدريتش	7732-18-5
قارورة ديوار واسعة الفم	سيغما ألدريتش	Z120790