$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تقييم تأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة على تكوين مستعمرات الحبيبات والأغشية الحيوية
- حضر محلول 2x من وسط MSgg (أحادي الصوديوم جلوتامات-جليسرول) المحفز للغشاف الحيوي بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد الحديد (III) سداسي الهيدرات. بعد تعقيم الفلتر، أضف كلوريد الكالسيوم. الوسط جاهز للاستخدام مباشرة، أو يمكن تخزينه عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- حضر تخفيف MSgg 1x في يوم التجربة.
- تخفيف متوسط MSgg مرتين إلى 1x بماء مقطر معقم (الحبيبات) أو أجار معقم بحرارة 3٪ (80 درجة مئوية) (أغشية حيوية) وأضف سداسي هيدريد الحديد (III) كلوريد إلى تركيز نهائي 50 ميكرومولار (الحبيبات) أو 250 ميكرومولار (الأغشية الحيوية). أضف المضادات الحيوية أو مثبطات الجزيئات الصغيرة إلى التركيز المطلوب وامزج جيدا. على سبيل المثال، للحصول على تركيز نهائي 0.5 ملليمول من D-ليوسين في 30 مل لتكوين الحبيبات أو الأغشية الحيوية، أضف 196.6 ميكرولتر من محلول مخزون D-ليوسين بوزن 76.3 ملليموتر (10 ملغ/مل).
ملاحظة: يتم وصف التركيبة النهائية ل 1x MSgg في الجدول 1. مقارنة بالوصفة الأصلية، احتوى الوسط على 50 ميكروغرام/مل ثريونين، وتم زيادة تركيز الحديد لزراعة مستعمرات الأغشية الحيوية على وسط MSgg الصلب 2.5 مرة لتحسين شكل المستعمرة المجعدة.
- بعد تصلب الأجار، جفف صفائح MSgg الصلبة في غطاء بيولوجي لمدة 30-45 دقيقة قبل التطعيم.
- لاختيار مثبطات محددة تتداخل مع آليات تكوين الحبيبات (الشكل 1)، استبعد أن التركيزات المستخدمة تؤثر على نمو العوالق والساكن.
- تحديد نمو العوالق (زيادة الكثافة البصرية مع مرور الوقت في الزراعة السائلة) في منحنى نمو بسيط عن طريق قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر كل ساعة حتى مرحلة النمو الثابتة.
- للتأكد من أن عكارة الزراعة المقاسة تمثل أعداد الخلايا الحية، حدد عدد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) للخلايا في مرحلة نمو العوالق من زراعة الاهتزاز في عدة نقاط زمنية.
- لتقييم تأثير مثبطات الجزيئات الصغيرة على نمو الحبيبات الثابتة، يتم جمع الخلايا في نهاية حضانة 3 أيام عند درجة حرارة 23 درجة مئوية من بئر زراعة خلايا مكونة من 24 بئرا، متلقحة تحت نفس الظروف الموضحة في الأقسام 1.7-1.9، وتحديد الوحدة الخالية من الفروع. لهذا الضابط، استخدم سلالة تفتقر إلى الحبيبات تفتقر إلى الأوبيرونات التي تشفر مكونات المصفوفة خارج الخلية (أي B. subtilis ΔepsH، ΔtasA).
ملاحظة: هذه السلالة قادرة على النمو تحت ظروف ثابتة، ولكن على عكس النوع البري المشكل للحبيبات، فهي تفتقر إلى القدرة على الطفو إلى واجهة السائل مع الهواء، حيث يفضل النمو بسبب ارتفاع مستويات الأكسجين. لذا، فإن هذا السلالة التي تفتقر إلى المصفوفة والحبيبات خارج الخلية هي سلالة مرجعية موصى بها لتقييم النمو في الظروف الثابتة.
ملاحظة: في المثال المحدد لحمض D-الأمين غير القانوني D-ليوسين الموضح أدناه، تم استبعاد تأثير النمو العوالقي والساكن عند تركيزات تتداخل مع تكوين الحبيبات. تم وصف الطرق لتحديد نمو العوالق والاستاتيك بالتفصيل.
- اخرج B. subtilis من مخزون بدرجة -80 درجة مئوية (مزرعة LB تحتوي على 109 خلايا/مل مجمدة في 20٪ جليسرول) لعزل مستعمرات واحدة على صفيحة أجار LB-1.5٪ مع رأس معقم أو عصا تطبيق.
- ينمو طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية.
- خطوة حاسمة: للحصول على تثبيط قوي للحبيبات بواسطة الأحماض الأمينية D غير التقليدية مثل D-ليوسين، ازرع مستعمرة واحدة ملتقطة من طبق الأجار LB-1.5٪ في مرق LB بسعة 3 مل عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات في حاضنة الاهتزاز (سرعة الاهتزاز 200 دورة في الدقيقة). استبدل مرق LB بوسط MSgg محفز الأغشية الحيوية قبل التلقيح عن طريق طرد مركزي بمقدار 1.5 مل من ثقافة البداية لمدة 4 دقائق عند 6000 × جرام، مع إزالة الفائق بعناية، وإعادة تعليق الحبيبات في وسط MSgg بسعة 1.5 مل. يمكن التخلص من بقية الثقافة. مهم: لضمان متانة النظام، يجب أن تكون الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD 600) لثقافة البدء المغسولة بين 0.6 و1.
- خلال نمو الزراعة المبدئية، حضر طبق متعدد الأطباق يحتوي على 3 مل من وسط MSgg بدون أو بنطاق تركيز من مثبط الجزيئات الصغيرة (مثل 0.3، 0.5، 1 ملليمولار D-ليوسين). لاستبعاد تأثيرات الحواف، وزع مواقع التركيزات المختلفة عبر الطبق متعدد الأطباق. بدلا من ذلك، استخدم أطباقا متعددة الأطباق بزراعة خلايا ب 24 بئرا تحتوي على 1.5 مل من وسط MSgg.
- قم بتحصين آبار الطبق متعدد الأطباق المكون من 12 بئر ب 3 ميكرولتر من الزراعة المغسولة (تخفيف 1:1,000).
ملاحظة: يمكن استخدام نسبة تخفيف أقل، أي 1:500. وهذا يقلل من وقت تطور الحبيبات. - نما الحبيبات عند 23 درجة مئوية تحت ظروف ثابتة لمدة ثلاثة أيام. لا تحرك الحبيبات خلال هذه الفترة، لأنها قد تؤثر على شكل السطح النهائي للحنية.
- التقط صورا بعرض منظار ومتجانس للبرق. بدلا من ذلك، التقط صورة للحبيبات باستخدام كاميرا عالية الدقة. لتجنب التشوهات الناتجة عن زوايا الضوء والظلال غير المتسقة، التقط صورا من الأعلى مع تثبيت الكاميرا على حامل ثلاثي واستخدم مصدر ضوء ناعم وكبير بزاوية 45° من كلا الجانبين.
ملاحظة: طريقة بديلة لدراسة تعدد الخلايا في B. subtilis هي اختبار مستعمرة الأغشية الحيوية على وسط MSgg الصلب الذي يسبب الغشاء الحيوي. مثل البليكلات، يسمح هذا الاختبار بدراسة العمليات الزمانية والمكانية. بمجرد تحديد النطاق النشط للمثبطات الجزيئية الصغيرة، يمكن دراسة تأثيرها على تكوين مستعمرات الغشاء الحيوي. - لزراعة مستعمرات الأغشية الحيوية، قم بوضع 1.5 ميكرولتر من الزراعة المسبقة غير المغسولة (الخطوة 1.7) بشكل متماثل على طبق الأجار المجفف MSgg بنسبة 1.5٪ بمساعدة قالب — 4 قطرات لكل طبق بتري بقطر 8.5 سم. دع القطرات تمتص إلى الصفيحة قبل تحريكها.
ملاحظة: يساعد القالب في الحصول على توزيع متساو لمستعمرات الغشاء الحيوي داخل المنطقة التي تنمو فيها الخلايا. لتحضير القالب، ارسم إجمالي مساحة النمو على المقاييس الأصلية، وقسمها إلى قطاعات متساوية وحدد المركز. بالنسبة لطبق بتري دائري بقطر 8.5 سم، يخصص هذا 14 سم2 إلى مستعمرة واحدة للأغشية الحيوية. - احتضن الصفائح عند 30 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. خلال هذه الفترة، تتطور مستعمرات الأغشية الحيوية وتشكل بنية ثلاثية الأبعاد مجعدة.
- التقط صورا كما في الخطوة 1.11.
الجدول 1. المقال النهائي 1x MSgg المستخدم في هذه الدراسة.
| 1.925 مللي مولار | فوسفات البوتاسيوم أحادي الأساس |
| 3.075 مللي مولار | فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدي |
| 100 مللي موتر | حمض بروبانسولفونيك 3-(N-مورفولينو)، درجة الحموضة 7.1 |
| 2 مللي مول | سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم |
| 700 ميكرومولار | كلوريد الكالسيوم غير مائي |
| 50 ميكرومولارأمبير | سداسي هيدريد كلوريد الحديد (III) |
| 125 ميكرومولارب |
| 1 ميكرومولار | كلوريد الزنك غير مائي |
| 2 ميكرومولار | هيدروكلوريد الثيامين |
| 50 ميكروغرام/مل | التربتوفان |
| 50 ميكروغرام/مل | فينيل ألانين |
| 50 ميكروغرام/مل | ثريونين |
| 0.5٪ (صوت/ضوء) | الجلسرون اللامائي |
| 0.5٪ (مع المقابلة) | حمض L-جلوتاميك أحادي الصوديوم ملح هيدرات |
| ألاختبار الحبيبات؛ Bلاختبار الأغشية الحيوية |
