اختبار مقاومة الإيثانول لتقييم سلامة مصفوفة الأغشية الحيوية

الملخص

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون. منهجيات دراسة B. subtilis Biofilms كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو كيف تؤثر سلامة مصفوفة الأغشية الحيوية على مقاومة البكتيريا للإيثانول من خلال مقارنة وحدات تكوين المستعمرات في الأغشية الحيوية غير المعالجة والمعرضة للمثبطات. تظهر الوحدات الخالية من الفروع الخالية في عينات المعالجة بالمثبطات أن المصفوفة خارج الخلية ضرورية لحماية الخلايا المدمجة في الأغشية الحيوية من الإجهاد المضاد للميكروبات.

البروتوكول

1. اختبار مقاومة الإيثانول

1. ازرع الأغشية الحيوية وبعد 68 ساعة من النمو عند درجة حرارة 30 درجة مئوية، قم بقطع مستعمرات الغشاء الحيوي إلى جزأين متساويين بمساعدة شفرة حلاقة وقالب.
2. ارفع بعناية كل نصف من مستعمرة الغشاء الحيوي من صفيحة الأجار باستخدام ملعقة صغيرة وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل يحتوي على 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). إذا لزم الأمر، قم بكشط الخلايا المتبقية من الصفيحة وانقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق أيضا.
   ملاحظة: يتم التعامل مع النصف الثاني من مستعمرة الغشاء الحيوي بشكل مختلف، حسب ما إذا كان هو العنصر الضابط أو لاختبار مقاومة العوامل المعقمة.
3. للضبط، حضن النصف الثاني من مستعمرة الغشاء الحيوي في 500 ميكرولتر PBS. لتقييم مقاومة عوامل التعقيم، انقل النصف الثاني من مستعمرة الغشاء الحيوي إلى 500 ميكرولتر 50٪ (v/v) إيثانول.
   ملاحظة: يمكن استخدام عوامل تعقيم بديلة مثل هيبوكلوريت الصوديوم. لجميع عوامل التعقيم المستخدمة، حدد التركيز النشط ووقت الحضانة في تجربة أولية.
4. حضن مستعمرات الغشاء الحيوي لمدة 10 دقائق على سطح الطاولة في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بعمل طرد مركزي على مستعمرات الأغشية الحيوية لمدة 5 دقائق عند 18,000 x g وإزالة المادة الفائقة بحذر باستخدام ماصة. أضف 300 ميكرولتر من PBS.
6. قم بسونيك الخلايا بشكل خفيف (سعة 10٪، نبضة 5 ثوان) باستخدام رأس ميكرو لجهاز السونيكات.
   ملاحظة: يجب أن تكون طاقة الصوت كافية لفصل تجمعات الأغشية الحيوية. ومع ذلك، قد يؤدي السونيك القوي جدا إلى تحلل الخلايا. تأكد مسبقا بالمجهر الضوئي أن طاقة الصوتية المستخدمة لا تتحلل الخلايا وأن جميع التجمعات مذابة.
7. أضف 700 ميكرولتر من PBS إلى حجم نهائي يبلغ 1 مل. قم بإجراء تخفيف تسلسلي (إلى ^10-7) في PBS ونشر 100 ميكرولتر من 3 تخفيفات على صفيحة أجار LB-1.5٪ باستخدام حبيبات زجاجية معقمة.
   ملاحظة: يجب تحديد التخفيفات المثلى التي يجب تغطيتها في تجربة أولية، حيث يعتمد ذلك على عدد الخلايا في مستعمرة الغشاء الحيوي المعنية ومعدل بقاء الخلايا استجابة لعامل التعقيم.
8. حضن الألواح طوال الليل عند درجة حرارة 30 درجة مئوية، عد الوحدة المعتمدة وحدد CFU/ml. من الوحدة النهائية لكل مستعمرة نصف الأغشية الحيوية، احسب نسبة الناجين.
   ملاحظة: عند إجراء وتحليل كما هو موصوف، يجب أن تحقق نصفي مستعمرة الغشاء الحيوي الضابط والنصف غير المعالج مقابل المعالج بالإيثانول فروقا أقل من 10٪ في عدد الخلايا القابلة للحياة، مما يتحقق من تناظر أو مقاومة المستعمرة على التوالي. بدلا من ذلك، يمكن تمثيل النتائج بإجمالي CFU. يجب أن يبقى عدد الخلايا في المستعمرة الضابطة والمستعمرة غير المعالجة في نفس الترتيب. في المقابل، من المتوقع أن تنخفض أعداد خلايا النصف المعالج بالإيثانول من مستعمرة الأغشية الحيوية المعالجة بجزيئات صغيرة بمقدار لا يقل عن درجتين من الدرجة للمطالبة بزيادة الحساسية تجاه عامل التعقيم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوريا بروت، لينوكس	ديفكو	240230
باكتو آجار	ديفكو	214010
فوسفات البوتاسيوم أحادي الأساس	سيغما، 136.09 جم/مول	P0662-500G
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدي	فيشر ساينتفيك، 174.18 جم/مول	BP363-1
حمض بروبانسولفونيك 3-(N-مورفولينو)	فيشر ساينتفيك، 209.27 جم/مول	BP308-500
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم	ميرك، 203.30 جم/مول	1.05833.0250
كلوريد الكالسيوم غير مائي	ج. ت. بيكر، 110.98 جم/مول	1311-01
رباعي هيدرات كلوريد المنغنيز(II)	سيغما، 197.91 جم/مول	31422-250G-R
سداسي هيدريد كلوريد الحديد (III)	سيغما، 270.30 جم/شهر)	F2877-500G
كلوريد الزنك غير مائي	أكروس أورجينيكس، 136.29 جم/مول	424592500
هيدروكلوريد الثيامين	سيغما، 337.27 جم/مول	T1270-100G
إل-تريبتوفان	فيشر ساينتفيك، 204.1 جم/مول	BP395-100
إل-فينيل ألانين	سيغما، 165.19 جم/مول	P5482-100G
إل-ثريونين	سيغما، 119.12 جم/مول	T8625-100G
الجلسرون اللامائي	Bio-Lab Itd	712022300
حمض L-جلوتاميك أحادي الصوديوم ترتبط	سيغما، 169.11 جم/مول	G1626-1KG
دي-ليوسين	سيغما، 169.11 جم/مول	855448-10G
الإيثانول اللامائي	غادوت	830000054
شفرة الحلاقة	إديسون	NA
أوراق التصفية الدائرية للسليلوز	واتمان، 90 مم	1001-090
جلوتارالديهايد	EMS (علم الميكروسكوبي الإلكتروني)، 25٪ في الماء	16220
بارافورمالديهايد	EMS، 16٪ في الماء	15710
كاكوديلات الصوديوم	ميرك، 214.05 جم/مول	8.2067
كلوريد الكالسيوم 2-هيدرات	ميرك، 147.02 جم/مول	1172113
شاكر 37 درجة مئوية	نيو برونزويك العلمية Innowa42	NA
الطرد المركزي	جهاز الطرد المركزي على الطاولة من إيبندورف 5424	NA
جهاز سونيفر رقمي، موديل 250، مستخدم مع دبل ستيب مايكروتيب	برانسون	NA
الحاضنة 30 درجة مئوية	المجلد	NA
الحاضنة 23 درجة مئوية	المجلد	NA
نظام الترشيح، 500 مل، بوليسترين	كورنيغ إنكوربوريتد	NA
الهزاز الدوار - دورة أوربيترون II	بوكل	NA