تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية للتحليل الشكلية

الملخص

المصدر: بوخر، ت.، وآخرون، منهجيات دراسة أغشية B. subtilis كنموذج لتوصيف مثبطات الأغشية الحيوية للجزيئات الصغيرة. J. Vis. Exp.(2016)

يوضح هذا الفيديو تحضير مستعمرات الأغشية الحيوية البكتيرية الناضجة للتصوير عالي الدقة. يغطي خطوات التثبيت، والتجفيف، والتثبيت، وطلاء المعادن للحفاظ على شكل الأغشية الحيوية وتصورها.

البروتوكول

تحضير عينات مستعمرة الأغشية الحيوية للمجهر الإلكتروني الماسح

1. ازرع مستعمرات بكتيرية حيوية.
2. حضر دفعة جديدة من محلول بارافورمالديهايد بنسبة 2٪ (v/v) ومحلول بارافورمالديهايد بنسبة 3٪ (v/v) في 100 ملليمول من كاكوديلات الصوديوم، و5 ملليمول من محلول كلوريد الكالسيوم، ودرجة حموضة 7.3. حضر 5 مل من المثبت لكل طبق بتري قطره 8.5 سم.
   تحذير: الجلوتارالديهيد والبارافورمالديهيد خطيرتان. تعامل معها باستخدام معدات السلامة داخل غطاء كيميائي. تخلص من المحاليل والمواد الملوثة في النفايات الخطرة.
3. أضف المثبت بعناية إلى مستعمرات الأغشية الحيوية، دون أن يصرف مباشرة فوق الأغشية الحيوية.
   ملاحظة: نظرا للطبيعة الكارهة للماء لمستعمرة الغشاء الحيوي، تنفصل المستعمرات تدريجيا عن الأجار وتبدأ في الطفو.
4. أغلق الألواح بعناية بشريط من Parafilm. حضانه على هزاز دوار لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم انقل الألواح إلى 4 درجات مئوية طوال الليل.
5. في اليوم التالي، قم بإزالة السائل بعناية باستخدام ماصة باستور متصلة بمضخة تفريغ.
6. أضف بحذر 10 مل من 100 ملليمول من كاكوديلات الصوديوم، و5 ملليمول من محلول كلوريد الكالسيوم لغسل الغشاء الحيوي وحضانه لمدة 5 دقائق. قم بإزالة السائل بلطف باستخدام ماصة باستور الزجاجية من زاوية اللوحة لتجنب إتلاف الغشاء الحيوي، وأضف محلول غسيل جديد باستخدام الماصات اللطيفة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
7. لتجفيف مستعمرات الغشاء الحيوي، تابع الخطوات التالية: 2x 5 دقائق في ddH₂O; مرتين 20 دقيقة بإيثانول 30٪؛ 2 مرة 20 دقيقة بإيثانول 50٪؛ مرتين لمدة 20 دقيقة بإيثانول 70٪؛ 2 مرة 20 دقيقة بإيثانول 96٪؛ مرتين لمدة 30 دقيقة مع إيثانول 100٪.
   1. أضف 15 مل من السائل لكل طبق بتري بقطر 8.5 سم في كل خطوة وأخرج السائل بعناية بعد كل حضانة.
8. استخدم إحدى طريقتين مختلفتين لتجفيف العينات من الإيثانول.
   1. للتجفيف بالهواء باستخدام الإيثانول:
      1. اقطع ورق فلتر السليلوز (قطر 9 سم) إلى أرباع. اغمر ربع الأغشية لفترة وجيزة في 100٪ إيثانول، ثم انقل بعناية مستعمرة أغشية حيوية عائمة عليها. ضع ورق الفلتر المبلل في طبق بترى مبطن بورق الفلتر. غط طبق بتري واترك مستعمرات الغشاء الحيوي تجف طوال الليل داخل غطاء كيميائي.
9. غطي شريط المجهر الإلكتروني بشريط كربوني. بمساعدة الملقط، انقل مستعمرات الغشاء الحيوي بعناية إلى القاعدة الصغيرة. ربط كل مستعمرة بالقطعة القصيرة عن طريق إضافة جسر رفيع من شريط الكربون، وهو أمر ضروري لإزالة الشحنة تحت شعاع الإلكترون. في هذه المرحلة، تعامل مع مستعمرات الغشاء الحيوي بحذر لأنها هشة جدا. احتفظ بالعينات في مجفف لمدة لا تقل عن 24 ساعة أو حتى الفحص.
10. في يوم الفحص، باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، غطى مستعمرات الأغشية الحيوية لمدة دقيقتين بزاوية 60° باستخدام طبقة معطلة من الذهب-بالاديوم. كرر هذه الخطوة مرتين وقم بتدوير العينات بزاوية 120° بينهما. في النهاية، قم بطبقة الطلاء على العينات مرة واحدة لمدة 3 دقائق من الأعلى. الطبقة الرقيقة بطول 20 نانومتر من الذهب-البلاديوم تحسن التوصيل وتعزز تباين العينة للتصوير في المجهر الإلكتروني الماسح.
11. تخزين العينات في مجفف لتجنب إعادة ترطيب العينة حتى التصوير بمجهر إلكتروني ماسح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الجلسرون اللامائي	Bio-Lab Itd	712022300
الإيثانول اللامائي	غادوت	830000054
شفرة الحلاقة	إديسون	NA
أوراق التصفية الدائرية للسليلوز	واتمان، 90 مم	1001-090
جلوتارالديهايد	EMS (علم الميكروسكوبي الإلكتروني)، 25٪ في الماء	16220
بارافورمالديهايد	EMS، 16٪ في الماء	15710
كاكوديلات الصوديوم	ميرك، 214.05 جم/مول	8.2067
كلوريد الكالسيوم 2-هيدرات	ميرك، 147.02 جم/مول	1172113
قاعدة الألمنيوم القصيرة	إسعاف، رأس مدمج	75230
شريط لاصق كربوني	خدمات الطوارئ الطبية	77825-12
شاكر 37 درجة مئوية	نيو برونزويك العلمية Innowa42	NA
الحاضنة 30 درجة مئوية	المجلد	NA
الحاضنة 23 درجة مئوية	المجلد	NA
الهزاز الدوار - دورة أوربيترون II	بوكل	NA
معطف S150 Sputter	إدواردز	NA
المجهر الإلكتروني الماسح البيئي	XL30 ESEM FEG Philips (FEI)	NA