نمذجة العدوى المعوية في يرقات سمك الزرد باستخدام البكتيريا المنقولة عن طريق الغذاء

الملخص

المصدر: فلوريس، إي. وآخرون. باستخدام البروتوزوان Paramecium caudatum كوسيلة للعدوى المنقولة عن طريق الغذاء في يرقات سمك الزرد. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو طريقة إنشاء نموذج عدوى بكتيرية معوية عبر الغذاء في يرقات سمك الزرد من خلال إطعامها الباراميسيا المصابة بالإشريكية الفلورية الفلورية.

البروتوكول

1. عدوى الأسماك المنقولة عن طريق الغذاء لدى سمك الزرد
   1. حضانة البكتيريا مع الباراميسيا.
      1. حضر زراعة مشتركة من Paramecium caudatum و Escherichia coli MG1655 في الليلة التي تسبق العدوى. اجمع 8 مل من وسط E3، و1 مل من مزرعة باراميسيا مستمرة، و1 مل من مزرعة الإشريكية القولونية MG1655 (OD₆₀₀ = 1.0) معلقة في 1x E3 في قارورة زراعة الأنسجة T25. حضن القوارير في درجة حرارة الغرفة (RT) طوال الليل. لكل حالة علاجية، حضر قارورتين من الباراميسيا.
      2. تلقيح وسط نمو البكتيريا (LB (مرق الليسوجيني): 1 جرام/لتر تريبتون، 0.5 ج/لتر مستخلص الخميرة، 1 جرام/لتر NaCl) بالسلالة المعدية من البكتيريا عن طريق اختيار مستعمرة بكتيرية فردية من صفيحة باستخدام حلقة تلقيح معقمة. حضن الزراعة السائلة عند 37 درجة مئوية واترك الرج عند 110 دورات في الدقيقة طوال الليل.
         ملاحظة: يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية (معطف مختبر وقفازات)، ويجب استخدام مرافق السلامة البيولوجية المستوى 2 عند التعامل مع العوامل المعدية.
      3. في اليوم التالي، قس جرعة الجرعة الزائدة₆₀₀ من الثقافة الليلية. احسب حجم الزراعة المطلوبة لتحقيق OD600 مقداره 1 عند إعادة تعليقها في 11 مل من الوسط.
      4. احصد حجم البكتيريا عبر الطرد المركزي بمقدار 6000 × جرام لمدة 5 دقائق، حجم واحد لكل قارورة باراميسيا. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من وسط E3.
      5. اختياريا، قم بصبغ البكتيريا مسبقا بصبغة فلورية.
         1. أضف 1 ميكرولتر من صبغة FM 4-64FX البكتيرية (محلول مخزوني 5 ملغ/مل). غط الأنبوب بورق الألمنيوم للحماية من التبييض الضوئي واحتضن الدوران من الطرف إلى الطرف عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
         2. أزل الصبغة الزائدة بغسلها ب 1x E3: بكتيريا الحبيبات عبر الطرد المركزي عند 6000 x جرام لمدة 1.5 دقيقة، ثم أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط E3. كرر خطوة الغسيل مرتين.
         3. احصد البكتيريا الملطخة عن طريق التلكم الجريء بقوة 6000 × جرام لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 1 مل من وسط E3.
      6. أضف 1 مل من التعليق البكتيري إلى كل من القارورتين من الباراميسيا الطازجة. حضن التمارين عند الريتل لمدة ساعتين.
         ملاحظة: إذا كنت تعمل مع بكتيريا مصبوغة، حضن في الظلام عند RT لمدة ساعتين
2. زراعة البكتيريا الواش والباراميسيا
   1. اجمع محتويات كلا القارورتين من زراعة الباراميسيا/البكتيريا المشتركة في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل. عينات الطرد المركزي عند 300 x g وعند 15 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تأكد من أن الطرد المركزي مبرد مسبقا قبل هذه الخطوة.
   2. إزالة حوالي 10 مل من المادة الفائقة E3 باستخدام ماصة مصلية وأضف حوالي 10 مل من 1x E3 الطازج إلى الأنبوب المخروطي.
      ملاحظة: خلال جميع خطوات الغسيل، من الضروري أن تكون سريعا جدا عند إزالة السوبرناتانت، لأن الباراميسيا ستبدأ بالسباحة خارج الحبيبة. قم بتدوير وإزالة السوبرناتينت من أنبوب واحد في كل مرة لضمان التعامل السريع في هذه الخطوة، وتجنب فقدان الباراميسيا في السوبرناتانت.
   3. قم بتدوير العينات عبر الطرد المركزي عند حرارة 300 x g عند 15 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بإزالة حوالي 10 مل من المادة الفائقة E3 باستخدام ماصة مصلية، وأضف حوالي 10 مل من 1x E3 الطازج إلى الأنبوب المخروطي. كرر هذه الخطوة مرتين.
   4. عينات الطرد المركزي عند 300 × جرام وعند 15 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. أزل حوالي 10 مل من السوبرناتانت E3، مع الحرص على عدم إفساد الحبيبة.
   5. أعد تعليق الحبيبات في ال 10 مل المتبقية من وسط E3 وانقل 500 ميكرولتر من التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل. قم بإزالة 500 ميكرولتر من الباراميسيا عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جرام لمدة 5 دقائق لحساب عدد الباراميسيا.
   6. إزالة 400 ميكرولتر من المادة الفائقة E3 من عينة 500 ميكرولتر. أضف 20 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 36.5٪ إلى ال 100 ميكرولتر المتبقي من الباراميسيا وأعاد تعليقها بلطف، ثم حضن لمدة 5 دقائق عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة تقتل الباراميسيا للسماح بالعد.
   7. قس الحجم الكلي الفعلي باستخدام الماصة وسجل. قم بتخفيف تعليق الباراميسيا بنسبة 1:1 v/v مع محلول أزرق trypan بنسبة 0.4٪.
   8. استخدم عداد الخلايا أو جهاز قياس الدم لحساب عدد الباراميسيا الميتة/مل.
      ملاحظة: بسبب خطوة التثبيت السابقة، ستكون معظم الباراميسيا ميتة في هذه المرحلة، لكن هذا العدد يعكس عدد الباراميسيا الحية لتجربة الحضانة المشتركة. لم يجد المؤلفون موتا كبيرا للباراميسيا بسبب الحضانة البكتيرية معا، لذا يمكن تجاهل هذا كعامل هنا.
3. يرقات باراميسيا وسمك الزرد المتزامنة
   1. احسب تركيز الباراميسيا في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل
   2. احسب حجم الباراميسيا المغسولة المطلوبة لتركيز 2 × 10⁵ باراميسيا/مل في حجم نهائي 3 مل من E3.
      ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الباراميسيا بناء على الجرعة البكتيرية المطلوبة، والتي تخضع للتحسين.
   3. تخدير سمك الزرد بإضافة الترايسين بدرجة حموضة ثلاثية 8.0 بدرجة حرارة 100 ململر إلى تركيز نهائي 100 ملغ/لتر. انقل 10 أسماك زرد إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار إلى حجم إجمالي 3 مل من E3 طازج يحتوي على التركيز المناسب من الباراميسيا. تأكد من نقل اليرقات في كمية قليلة من السائل لضمان تعافيها من التخدير في بئر المتلقي.
   4. حضن عند حرارة 30 درجة مئوية لمدة ساعتين في حاضنة نهارية تحت ظروف النهار، لضمان ظروف إضاءة مثالية للصيد.
   5. غسل سمك الزرد 5 مرات على الأقل عن طريق نقل الأسماك إلى بئر جديد يحتوي على 3 مل من E3 الطازج يحتوي على 100 ملغ/لتر تريكين في كل مرة.
      ملاحظة: لا تحاول حذف الترايسين أثناء خطوة الغسيل. نقل اليرقات المتحركة بدون تخدير يزيد من خطر الضرر والضيق للحيوان.
   6. اختياريا، تحضير سمك الزرد للتصوير عن طريق تضمين سمك الزرد في 3 مل من أجوروز منخفض الذوبان 1٪ في صفيحة ذات جدران سوداء مكونة من 6 آبار: الأغاروز منخفض الذوبان يتكون من 1xE3 ويسخن في ميكروويف. بعد أن يذوب الترايسين، أضف التريكائين إلى تركيز نهائي يبلغ 160 ملغ/مل. ضع الأسماك تحت المجهر المجسم، باستخدام رأس جل مقطوع، مع التأكد من أن الرأس على اليسار والذيل على اليمين (الشكل 1). انتظر 5 دقائق حتى يستقر الأغاروز، ثم ضع على الأسماك المدمجة 1x E3 تحتوي على 160 ملغ/مل تريكين للتصوير.

النتائج

الشكل 1: استعمار سمك الزرد مع البكتيريا. تم ترك سمك الزرد عند 5 dpf غير مصاب (A) أو استعمر ب mCherry الذي يعبر عن (B) E. coli أو (C) سالمونيلا إنتيريكا قد تجرى تجارب في أسماك...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
باراميسيوم كوداتوم، مباشر	كارولينا	131554	لا، لا تخزن زراعة الزراعة تحت درجة حرارة الغرفة
محلول تريبان الأزرق بنسبة 0.4٪	سيغما	T8154-20ML	سائل، مصفى بالتصفية، مناسب لزراعة الخلايا؛ تم تحضيره في كلوريد الصوديوم 0.81٪ وفوسفات البوتاسيوم 0.06٪ ثنائي البازي
كبريتات ثنائي ميثيل (DMSO)	سيغما	276855-100ML	تخزين في خزانة أمان المذيبات
الإشريكية القولونية، MG1655	ATCC	700926 ATCC	يمكن استبداله بأي سلالة أخرى غير ممرضة من الإشريكية القولونية
صبغة FM 4-64FX	ثيرمو فيشر	F34653	aliquot و Store Frozen
الفورمالديهايد	سيغما	F8775-4X25ML
إل بي بروث	سيغما	L3397-1KG
أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات	ثيرمو فيشر	18912014
تترا سايكلين	سيغما	87128-25G	سام، مهيج
تريكائين (إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثانيسلفونات)	سيغما	E10521-10G
ترايتون X-100	سيغما	X100-100ML
محلول تريبان الأزرق، 0.4٪	سيغما	93595-50ML
أغاروز ألترا بيور منخفض الانصهار	ثيرمو فيشر	16520050
مقياس الدم أو عداد الخلايا	أي
المجهر المجسم	أي
جهاز الطرد المركزي على سطح الطاولة
الميكروويف
عجلة الدوار
حاضنة الاهتزاز الساخنة
مرافق الألعاب المائية
أحواض التكاثر