تطوير طبقة حيوية أحادية الطبقة باستخدام مفاعل كهروكيميائي

الملخص

المصدر: توكونو، ي. وآخرون، الكشف الكهروكيميائي لتأثير نظائر الديوتيريوم الحركية على نقل الإلكترونات خارج الخلية في شيوانيلا أونيدينسيس MR-1. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو تجميع وتشغيل نموذج مفاعل كهروكيميائي مصمم لمحاكاة تكوين الأغشية الحيوية على أسطح الأقطاب. التحفيز الكهروكيميائي المتحكم به يعزز التصاق الميكروبات، مما يؤدي إلى تطور تدريجي لطبقة بيولوجية أحادية الطبقة البكتيرية.

البروتوكول

1. بناء مفاعل كهروكيميائي بثلاثة أقطاب كهربائية (الشكل 1)
   1. ضع ركيزة أكسيد القصدير المنشط بالإنديوم (ITO) كقطب عمل في أسفل المفاعل.
   2. بعد ذلك، يتم إدخال أسطوانة زجاجية (قطرها 2 سم) وغطاء من بولي تترافلوروإيثيلين (PTFE). ثم أدخل كلوريد الفضة/الفضة (Ag/AgCl) (كلوريد البوتاسيوم، KCl مشبع) وسلك بلاتين في المفاعل كأقطاب مرجعية ومضادة على التوالي.
      ملاحظة: لمنع تسرب الهواء والمحلول، أدخل صفيحة مطاطية من البوتيل بين كل مكون.
   3. أضف 4.0 مل من الوسط المحدد (DM) مع 10 ملليمول لاكتات ومستخلص خميرة 0.5 ج/لتر إلى المفاعل الكهروكيميائي.
   4. بعد التأكد من عدم وجود تسرب من المفاعل الكهروكيميائي، قم بتدفق غاز النيتروجين إلى المفاعل الكهروكيميائي لمدة 20 دقيقة للحفاظ على الظروف اللاهوائية داخل المفاعل الكهروكيميائي.
      ملاحظة: لمنع التلوث بميكروبات أخرى، يجب ترشيح الغاز قبل تدفقه إلى المفاعل الكهروكيميائي.
   5. قم بتوصيل المفاعل الكهروكيميائي ببوتنشيستات وتطبيق جهد +0.4 فولت (مقابل قطب الهيدروجين القياسي، SHE) على قطب ITO، مع الحفاظ على درجة حرارة المفاعل الكهروكيميائي عند 30 درجة مئوية باستخدام نظام تدوير مياه خارجي.
      ملاحظة: لمنع تأثير المجال الكهربائي الخارجي، يجب وضع المفاعل الكهروكيميائي في قفص فاراداي.
2. الزراعة الكهروكيميائية لخلايا S. oneidensis MR-1 (الشكل 1 والشكل 2)
   1. اضبط كثافة الخلايا للتعليق الناتج في الخطوة 1.1 إلى كثافة بصرية تبلغ 1.43 عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) مع DM مع إضافة 10 مللي مولار لاكتات ومستخلص خميرة 0.5 ج/لتر.
      ملاحظة: للحصول على OD₆₀₀ الصحيح، قم بتطبيق تعليق الخلية من OD₆₀₀ ≤ 0.8 على مطياف UV-vis قبل تعديل OD₆₀₀ إلى 1.43.
   2. أضف 0.3 مل من تعليق الخلية إلى المفاعل الكهروكيميائي عبر منفذ الحقن باستخدام حقنة: يتغير OD₆₀₀ في المفاعل إلى 0.1.
      ملاحظة: إضافة تعليق خلوي بمقدار 0.3 مل مع OD₆₀₀ = 1.43 إلى مفاعل كهروكيميائي يحتوي على وسط 4.0 مل ينتج عنه 4.3 مل من المحلول مع OD₆₀₀ = 0.1. عند استخدام مفاعلات أخرى بأحجام مختلفة، يلزم حساب كثافة الخلية.
   3. استمر في التطبيق المحتمل عند +0.4 فولت (مقابل SHE) على قطب ITO لمدة 25 ساعة.
      ملاحظة: لتكوين طبقة حيوية أحادية الطبقة على قطب ITO، تأكد من أن التيار المنتج يظهر انحرافا أقل من 50٪ عن الشكل 2.

النتائج

الشكل 1: المفاعل الكهروكيميائي المستخدم في هذه الدراسة. صورة فوتوغرافية للخلية الكهروكيميائية قبل البناء (أ) وبعد البناء (ب). (ج) رسم تخطيطي للمفاعل الكهروكيميائي بعد 25 ساعة من التلقيح الكهروكيميائي عند +0.4 فولت مقابل SHE.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أسطوانة زجاجية	لا يوجد	لا يوجد	مصنوع خصيصا، يستخدم كمفاعل كهروكيميائي
غطاء وقاعدة PTFE	لا يوجد	لا يوجد	مصنوع خصيصا، يستخدم كغطاء وأساس للمفاعل الكهروكيميائي
مطاط بوثيل	لا يوجد	لا يوجد	مصنوع خصيصا، يدرج بين كل مكون من مكونات المفاعل الكهروكيميائي
سيبتا	علوم GL	3007-16101	يستخدم كمنفذ حقن لمفاعل كهروكيميائي
قطب أكسيد القصدير المطعم بالإنديوم (ITO)	جيوماتيك	رقم 0001	يستخدم كقطب عامل، 5Ω/sq
قطب مشبع KCl Ag/AgCl	هوكوتو دينكو	HX-R5	يستخدم كقطب مرجعي، Φ0.30mm
سلك بلاتين	تعاونية نيلاكو	PT-351325	يستخدم كقطب مضاد
لوريا-بيرتاني (LB) بروث، ميلر	بيكتون، ديكنسون وشركاه	244620	وسط لما قبل الزراعة لجرعة S. oneidensis MR-1
باكتو آجار	بيكتون، ديكنسون وشركاه	214010
NaHCO₃	واكو	191-01305	يستخدم للوسط المحدد (DM)
CaCl₂·2H₂O	واكو	031-00435	يستخدم في DM
NH₄Cl	واكو	011-03015	يستخدم في DM
MgCl₂·6H₂O	واكو	135-00165	يستخدم في DM
NaCl	واكو	191-01665	يستخدم في DM
2-[4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينيل] حمض الإيثانيسلفونيك (HEPES)	دوجيندو	346-08235	يستخدم في DM
محلول الصوديوم اللاكتات	واكو	195-02305
مستخلص خميرة البكتو	بيكتون، ديكنسون وشركاه	212750
أكسيد الديوتيريوم (D، 99.9٪)	مختبرات كامبريدج للنظير، المحدودة.	DLM-4-PK	الجمع لتجارب تأثير النظائر الحركية
الحاضنة	طوكيو ريكاكيكاي المحدودة	LTI-601SD	يستخدم في الزراعة قبل الزراعة
شاكر	تايتك	NR-3	يستخدم في الزراعة قبل الزراعة
آلة الأوتوكلاف	شركة تومي سيكو المحدودة.	LSX-500	يستخدم لتعقيم المفاعل الكهروكيميائي والوسط
المقعد النظيف	سانيو	MCV-91BNF	يستخدم لمنع تلوث المفاعل الكهروكيميائي والوسط بميكروبات أخرى
فاصل الطرد المركزي	إبندورف	5430R	السرعة الدورانية المطلوبة تصل إلى 6000×g
مولد غاز النيتروجين	شركة بويكو المحدودة.	PNTN-2	يمكن أيضا استخدام أسطوانة غاز النيتروجين بدلا من مولد الغاز
مطياف الأشعة فوق البنفسجية البصرية	شيمادزو	UV-1800	يستخدم لتحسين كثافة الخلايا
البوتنشيستات	بيولوجيولوجي	VMP3	يستخدم في تكوين الأغشية الحيوية وتجارب تأثير النظائر الحركية
دورة المياه الحرارية	كواحد	TR-1A	يستخدم لصيانة درجة حرارة المفاعل الكهروكيميائي
قفص فاراداي	هوكوتو دينكو	HS-201S	يستخدم في التجارب الكهروكيميائية