تصور الإجهاد التأكسدي الناتج عن الممرض لدى C. elegans باستخدام SKN-1 الموسوم ب GFP

الملخص

المصدر: ناجي، أ.، وآخرون. دراسة الإجهاد التأكسدي الناتج عن مجموعة التهاب الترث العقدي في التهاب العين العقدي العقدي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو استخدام بروتين فلوري أخضر موسوم ب SKN-1 في C. elegans لمراقبة الإجهاد التأكسدي من خلال تتبع التألق الأخضر. تظهر الديدان المعرضة ل S. gordonii فلورة نووية قوية، مما يؤكد الإجهاد الناتج عن الممرض، بينما تظهر تلك التي تغذى الإشريكية القولونية فلورة خضراء منتشرة في السيتوبلازم، مما يشير إلى تنشيط SKN-1 ضئيل.

البروتوكول

1. ملاحظة تحديد موقع SKN-1 استجابة لعدوى المكورات العقدية العقدية

1. أضف ~100 يرقة L4 إلى كل مستخلص خميرة تود-هيويت (THY) مزروع بالمكورات العقدية ، ولكل وسط نمو للدودة الخيطية (NGM) طبق أجار مزروع بالإشريكية القولونية (E. coli). استخدم ثلاث أطباق لكل سلالة من البكتيريا. حضن الألواح لمدة 2 إلى 3 ساعات عند 25 درجة مئوية.
2. بعد ذلك، إزالة الألواح من الحاضنة، واغسلها باستخدام مخزن M9 معدل (M9W)، وجمع الديدان في أنابيب مخروطية بحجم 15 مل.
3. اغسل الديدان ثلاث مرات.
4. قم بإزالة معظم M9W عن طريق الشفط وإضافة 500 ميكرولتر من M9W التي تحتوي على 2 ملليمولار أزيد الصوديوم أو 2 ملليمولار تيتراميسول هيدروكلوريد إلى حبيبة الدودة. هذا يخدر الديدان، مما يضمن عدم حدوث أي حركة عند تصويرها تحت المجهر.
   تحذير: استخدم معدات الحماية الشخصية (PPE) عند التعامل مع أزيد الصوديوم. حضر محلول الأزيد تحت غطاء كيميائي.
5. حضن حبيبات الديدان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة. ثم ضع 15 ميكرولتر من تعليق الدودة على وسادة أجاروز محضرة. ضع غطاء رقم 1.5 بلطف فوق وسادة الأغاروز التي تحتوي على الديدان المخدرة.
6. باستخدام المجهر الفلوري، يمكنك تصور تحديد موقع عامل النسخ 1 من عائلة سكينهيد أو SKN-1:GFP (موسوم ببروتين فلورسنت أخضر SKN-1) باستخدام مرشحات فلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC) و4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI). صور تتضخم ب 10x و20x.
7. قم بتقييم الديدان بناء على مستوى تحديد موقع SKN-1. عدم وجود توطين نووي، وتحديد موقع SKN-1B/C::GFP (متساوي شكل SKN-1 B/C الموسوم ببروتين فلوري أخضر وعلامة عليه) في الجهة الأمامية أو الخلفية للدودة، والتموقع النووي ل SKN-1B/C::GFP في جميع خلايا الأمعاء يتم تصنيفها كمستويات منخفضة ومتوسطة وعالية من التموقع على التوالي.
8. بعد تقييم الميكروغرامات الفلورية، حدد الفروق الإحصائية باستخدام اختبار كاي تربيع واختبارات فيشر الدقيقة باستخدام برامج إحصائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الوسائط والمواد الكيميائية
مرق BD Bacto Todd Hewitt	فيشر ساينتيفك	DF0492-17-6
أنابيب الطرد المركزي المخروطية المعقمة من البولي بروبيلين بسعة 15 مل	فيشر ساينتيفك	12-565-269
أزيد الصوديوم	سيغما ألدريتش	S2002-25G
هيدروكلوريد رباعي السول	سيغما ألدريتش	L9756
غطاء رقم 1.5 بمقاس 18 مم × 18 مم	فيشر ساينتيفك	12-541A
أغاروز	سيغما ألدريتش	A9539-50G
LD002	IdIs1	SKN-1B/C::GFP + رول-6(SU1006)	كيث بلاكويل