إعداد نموذج شفط الفم الفموي في الفأر لتحديد عدوى الرئة البكتيرية

الملخص

المصدر: نيلسن، ت. ب. وآخرون، نموذج استنشاق الفم الفموي في الفأر للالتهاب الرئوي البكتيري المرتبط بجهاز التنفس الصناعي والاكتساب في المستشفى. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو عملية نقل البكتيريا عبر البلعوم الفموي إلى رئتي فأر مخدر لتحفيز عدوى الرئة وتحفيز استجابة مناعية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تلقيح/إصابة الفئران

1. تعلق فأرا مخدرا، وعلقته من القواطع العلوية على خيط قوي ورفيع (مثل خيط الأسنان) مثبت على جسم ثابت على ارتفاع يقارب ضعف طول جسم الفأر (مثل 20 سم) فوق سطح التشغيل (مثل طاولة المختبر).
2. اسحب لسان الفأر بلطف من فمه باستخدام ملقط معقم وغير مباشر. انقل اللسان إلى إصبع معقم يرتدي القفاز لمنع سحق لسان الفأر عن طريق الخطأ. أبق اللسان خارج الفم، مما يسمح بالوصول إلى الفم الفمي ومنع ابتلاع اللقاح إلى الجانب.
3. أثناء إمساك لسان الفأر، ضع اللقاح (تعليق بكتيريا) بسعة 50 ميكرولتر في الفم الفمي باستخدام ميكروبيبت؛ يقع اللحموم الفموي عند نقطة التقاء تجويف الفم والبلعوم باتجاه مؤخرة الفم.
   ملاحظة: من المهم جدا توصيل السائل فقط عن طريق التوصيل إلى المحطة الأولى على الميكروبايبت. يتوقف الفأر عن التنفس لبضع ثوان عندما يوضع اللقاح في البلعوم؛ في النهاية، يؤدي الشفط الانعكاسي إلى استنشاق الفأر للتعليق البكتيري، كما يتضح من صوت الفرقعة المميز لدخول السائل إلى الرئتين، مما يؤدي إلى عدوى الالتهاب الرئوي.
4. إذا لم يكن اللقاح بعيدا بما يكفي لمنع التنفس الطبيعي، اضغط على الأنف بالملقط لإجبار الشفط الانعكاسي عبر الفم والاستنشاق اللاحق للتلقيح.
5. بعد التطعيم، حرر اللسان، أزل الفأر من خيط التعليق، وضعه في قفص، وراقب حتى يستيقظ من التخدير.

2. مراقبة تقدم المرض

ملاحظة: بسبب معاناة الحيوانات، يجب استخدام مؤشرات مختلفة للدلالة على متى تصبح الفئران ميتة؛ يجب تنفيذ القتل الرحيم بعد هذا التحديد، وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد مسبقا؛ تشمل مؤشرات الموت المختلفة درجة حرارة الجسم، فقدان الوزن، المظهر، المشي، وعلامات حيوية أخرى يمكن الحصول عليها من الدم (مثل iSTAT).

1. قم بقتل الفئران وفقا لبروتوكول IACUC المعتمد سابقا (مثل ثاني أكسيد الكربون₂ متبوعا بخلع عنق الرحم).
2. قم بإزالة الرئتين من فأر تم إعداده عن طريق قطع القصبة الهوائية والشريان الرئوي والوريد الرئوي بالقرب من الرئتين.
   1. المجهر
      1. ضع الرئتين (أو الجزء) في قالب عينة.
      2. املأ قالب العينة بمركب درجة حرارة القطع المثلى (O.C.T.)، يغمر الأنسجة بالكامل.
      3. جمد العينة عند -80 درجة مئوية.
      4. أرسل العينة إلى مختبر علم الأمراض لتقسيمها وتركيبها على شرائح للمجهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
غرفة التخدير	مؤسسة كينت العلمية	فيتفلو-0720	يستوعب حتى 5 فئران
كريومولد، الحجم المتوسط	ساكورا أنديل تيك	4566	قوالب عينات فينيل قابلة للاستخدام، 15×15×5 مم
خيط الأسنان	أورال-بي	37000469537	ربط العمود المستقر تقريبا 6 إنشات فوق ارتفاع الطاولة
الملقط	VWR	82027-440	كان يستخدم لسحب اللسان برفق من فم الفأر
الإيزوفلوران للتخدير	أبوت	10015516	يمكن استخدام دواء بديل؛ تعديل الإجراءات وفقا لذلك
خرطوشة iSTAT	أبوت	03P79-25	تتوفر عدة خراطيش تناسب احتياجاتك
كيتامين، 100 ملغ/مل	ويسترن ميديكال سبلاي	4165	قم بتخفيف 1:10 في PBS إلى 1 ملغ/مل وادمج مع زيلازين بمقدار 1 ملغ/مل
مرهم للعيون	أكورن	الدموع متجددة	تجنب لمس العين بطرف الموزع
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	كورنينغ	21-031-CM	PBS من دولبيكو بدون كالسيوم والمغنيسيوم
أطراف الماصبة، 200 ميكرولتر	VWR	10017-044	جهاز الأوتوكلاف قبل الاستخدام
ماصية، 200 ميكرولتر	جيلسون	بيبيتمان P200	المعقم ومعايرته قبل الاستخدام
الموزع، الخلية البكتيرية	بيل-آرت	F377360006	قم بالتعقيم بالخبز أو التعقيم قبل كل استخدام
قارورة، مبريد، 2.0 مل	كورنينغ	430659	يستخدم في التخزين المجمل للحقن البكتيرية المركزة بالتبريد