العلاج بتنشيط الضوء للأغشية الحيوية البكتيرية باستخدام مادة حساسة للضوء

الملخص

المصدر: تشاو، ك. وآخرون. نموذج في المختبر لدراسة تأثير العلاج الضوئي الديناميكي بحمض 5-أمينولفولينيك على الغشية الحيوية المجمعة العنقودية الذهبية . J. Vis. Exp. (2018)

يعرض الفيديو بروتوكول العلاج الضوئي الديناميكي لتقييم التأثيرات المضادة للبكتيريا على الأغشية الحيوية البكتيرية الموجبة جرام. تنقسم الأغشية الحيوية إلى أربع مجموعات: اثنتان تحصلان على مادة تحسس ضوئية، واثنتان تتلقيان مخزن مؤقت. جميعها تحتضن في الظلام، تليها التعرض للضوء الأحمر لمجموعة واحدة معالجة بالمقدمات ومجموعة واحدة فقط من المخزن الخازم. تنتج أنواع الأكسجين التفاعلي فقط في المجموعة التي تتلقى كل من السلف والضوء، مما يؤدي إلى موت الخلايا البكتيرية. يتم مقارنة قابلية الحياة عبر جميع المجموعات لتقييم فعالية العلاج.

البروتوكول

1. تكوين الأغشية الحيوية

1. تكوين الأغشية الحيوية في صفائح دقيقة ذات 96 بئرا
   1. استرجع سلالة المكورات العنقودية الذهبية USA300 وثلاث سلالات سريرية تشكل الأغشية الحيوية (C1-C3) المخزنة عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم تحديد قدرة السلالات السريرية على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة اختبار صفيحة الميكروتيتر.
   2. قم بتلقيح البكتيريا في وسط مرق الصويا التريبتون (TSB) بسعة 5 مل، ثم زرعه في حاضنة مع هز على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل حتى الطور الثابت.
   3. قم بعمل الطرد المركزي في الزراعة البكتيرية الليلية بحرارة 4,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى تركيز نهائي يبلغ 2.0 × 10⁹ وحدات تكوين مستعمرات (CFU)/مل.
      ملاحظة: تم تقدير تركيز البكتيريا بقياس الكثافة البصرية وتحديد ذلك بعدد الصفائح، مما كشف أن 1 OD₆₀₀ من التعليق يحتوي على 1.5 × 10⁸ CFU/mL.
   4. قم بتخفيف التعليق البكتيري إلى 1:200 (1.0 × 10⁷ CFU/mL) في وسط TSB يحتوي على 0.5٪ جلوكوز. قم بتلقيح 200 ميكرولتر من التعليق البكتيري في كل بئر من صفيحة ميكرو معالجة بزراعة الخلايا من البوليسترين بسعة 96 بئر.
   5. حضن الصفيحة الصغيرة ثابتا عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في بيئة مؤكسجة جيدا.
      ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة لتكون الغشاء الحيوي الناضج لسلالات بكتيرية مختلفة؛ يجب تحديد ذلك قبل تجربة العلاج الضوئي الديناميكي (PDT).
   6. تخلص من الوسائط في الآبار واغسل آبار الميكروبليت بلطف باستخدام PBS ثلاث مرات ثم تخلص من السوبرناتانت.
      ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة بلطف شديد لتجنب إزعاج الغشاء الحيوي المتكون.

2. الإشعاع الضوئي

1. خزن حمض 5-أمينولفولينيك (5-ALA) في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية. قبل التجربة، قم بتخفيف 5-ALA مع PBS إلى 10 مللي مول.
   ملاحظة: يجب تحضير محلول 5-ALA طازجا قبل التجربة.
2. في المجموعة التجريبية، أضف 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار ALA إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة أو 2 مل إلى طبق الزراعة. غط الطبق/الطبق بورق الألمنيوم، واحتضن لمدة ساعة. ثم تتعرض للوحة/الطبق بإشعاع ثنائي ثنائي يصدر الضوء (LED) بقوة خفيفة تبلغ 100 mW/cm² لمدة ساعة واحدة لتحقيق جرعة خفيفة تبلغ 360 J/^cm2 عند طول موجي رئيسي 633 ± 10 نانومتر.
   ملاحظة: لكي تنقل طاقة الضوء بشكل فعال ومتساو إلى الغشاء الحيوي في جميع الآبار/الأطباق، ثبت المسافة من ذروة مصدر الضوء إلى البئر/الطبق عند 6.0 سم، وحدد منطقة التجربة إلى منطقة الإشعاع المركزية (10 سم × 8 سم). لضمان أن النتائج قابلة للتكرار، يجب إجراء التجارب في نفس درجة حرارة الغرفة. في خطوة إشعاع LED، لتجنب تعرض اللوحة مباشرة لمصادر ضوء أخرى مثل ضوء الشمس، إضاءة الغرفة، أو ضوء المصباح، كان يتم تشغيل LED قبل نقل اللوحة/الطبق إلى منطقة الإشعاع، وكان الضوء ساطعا بما يكفي لإكمال العملية.
3. تم إعداد مجموعات التحكم (تم تحديد ثلاث مجموعات ضابطة في تجربتنا).
   1. بالنسبة للمجموعة الضابطة الأولى (ALA-LED-)، أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة أو 2 مل إلى طبق الزراعة. غط الطبق/الطبق بورق الألمنيوم، واحتضنه لمدة ساعتين.
   2. بالنسبة للمجموعة الضابطة الثانية (ALA+LED-)، أضف 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار ALA لكل بئر من الصفيحة الدقيقة أو 2 مل إلى طبق الزراعة. غط الطبق/الطبق بورق الألمنيوم، واحتضنه لمدة ساعتين.
   3. بالنسبة للمجموعة الضابطة الثالثة (ALA-LED+)، أضف 200 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من الصفيحة الدقيقة أو 2 مل إلى طبق الزراعة. غط الطبق/الطبق بورق الألمنيوم، وحضنه لمدة ساعة. ثم تعرض اللوح لإضاءة LED بقوة 360 J/cm² بطول موجي رئيسي يبلغ 633 ± 10 نانومتر.
      ملاحظة: في خطوة إشعاع LED، تجنب التعرض المباشر لللوحة لمصادر ضوء أخرى مثل ضوء الشمس، إضاءة الغرفة، أو ضوء المصباح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق الصويا التريبتون (TSB)	أوكسويد	CM0129B
SYTO9	ثيرمو فيشر العلمي	L7012	مجموعات البكتيريا الحية/الميتة من باكلايت
يوديد البروبيديوم (PI)	ثيرمو فيشر العلمي	L7012	مجموعات البكتيريا الحية/الميتة من باكلايت
حمض 5-أمينولفولينيك (ALA)	فودان تشانغجيانغ للصيدلة الحيوية	3.1
سلالة المكورات العنقودية الذهبية USA300			مراجع في USA 300
السلالات السريرية المكورات العنقودية الذهبية (C1-C3)			تم عزل جميع السلالات السريرية من مرضى يعانون من التهاب الجيوب الأنفية المزمن
صفيحة دقيقة ببئر 96	شركة كورنينج	3599	ألواح دقيقة شفافة ومسطحة قاع من البوليسترين معالجة ب TC، ملفوفة بشكل فردي، مع غطاء، معقمة
جهاز الطرد المركزي الدقيق إيبندورف 5417	إبندورف	Z365998 | سيغما
الحاضنة	ثيرمو فيشر العلمي	SHKE4000	أجهزة MaxQ 4000 ذات السطح الطاولة من المدار
الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED)	شركة ووهان ياجي للتقنية البصرية والإلكترونية	LED-IB