تحضير العينة وتصوير البكتيريا الموسومة بالفلورية

الملخص

المصدر: تشيتريت، د.، وآخرون. تطبيق تصوير الخلايا الحية والتصوير المقطعي بالإلكترونات الباردة لتحديد الخصائص المكانية والزمنية لنظام إفراز الليجيونيلا الرئوية نقطة/ICM. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو تحضير وتصوير البكتيريا الممرضة الموسومة بالفلورية. يتم أولا تحضير وسائد الأغاروز ووضعها داخل إطار لاصق. يتم تطبيق تعليق من البكتيريا المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين فلوري على الوسادة لتثبيت الخلايا. ثم يغلق الإطار بغطاء ويتم مراقبته تحت المجهر لالتقاط صور فلورية للبكتيريا.

البروتوكول

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات التي تشمل نمو ومعالجة وتصوير L. pneumophila في مختبر السلامة البيولوجية المستوى 2 وفقا للإرشادات المحلية.

1. إدخال sfGFP في كروموسوم Legionella pneumophila باستخدام تبادل أليلي واستراتيجية الانتقاء المزدوج (الشكل 1، الشكل 2)

1. استنساخ التسلسل التالي في ناقل استبدال الجين pSR47S11: 1000 بيس أعلى الموقع المعني، ثم تسلسل sfGFP، ثم 1000 بيس أسفل الموقع المعني (الشكل 1). يجب وضع تسلسل sfGFP في إطار الطرف N أو نهاية C مع رابط يحتوي على أربعة إلى ثمانية أحماض أمينية. حول المتجه الناتج إلى إشريشيا قولونية DH5αλpir. لاحقا، ينمو الشريط L. pneumophila (المتلقي) لمستعمرات منفردة على مستخلصات الفحم والخميرة (CYE) التي تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وينمو لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية (الشكل 2).
2. Streak L. pneumophila على CYE-agar-ستريبتوميسين وينمو لمدة يومين عند 37 درجة مئوية (رقعة ثقيلة). تم تحويل سلسلة إشريكية قولونية DH5α باستخدام بلازميد مساعد pRK600 (مساعد) على أجار LB يحتوي على 25 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول. اترك سلسلة الإشريكية القولونية DH5αλpir (المتبرع) على أجار LB يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين.
3. قم بإجراء التزاوج الثلاثي الأبوي: حضانة مستعمرة من المساعد، ومستعمرة المتبرع، والمستلم عن طريق تراكب بقع من السلالات الثلاث على صفيحة أجار CYE دون الانتقاء والاحتضان لمدة 4–8 ساعات عند درجة حرارة 37 °م. كعناصر ضيبية، يتم حضانة مزيج سلالة مساعدة+متلقي ومزيج سلالة متبرعة+متلقية لنفس الفترات الزمنية.
4. أعد تعليق تفاعلات التزاوج في 500 ميكرولتر من ddH₂O. صفائح 20 ميكرو لتر و50 ميكرولتر من التفاعلات على أجار CYE تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين و10 ميكروغرام/مل كاناميسين وتنمو لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية. تجمع أربعة من النسخ الناتجة على أجار CYE تحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وتنمو لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.
5. سلسلة 16 نسخة مستنسخة على CYE Agar تحتوي على 5٪ سكروز و100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين وتنمو لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية. ثم، قم بمسح 32 من هذه النسخ على أجار CYE يحتوي على 100 ميكروغرام/مل ستربتومايسين وعلى أجار CYE يحتوي على 100 ميكروغرام/ملتر ستربتوميسين و10 ميكروغرام/ملليتر كاناميسين وتنمو لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية.

2. عزل النسخ التي دمجت sfGFP في كروموسوم L. pneumophila

1. تؤكد نسخ الخطوط التي كانت حساسة للكاناميسين على صفائح CYE-agar-Streptomycin إدخال sfGFP في الكروموسوم عبر تفاعل بوليميراز المتسلسل (PCR). استخدم بادئات مكملة لجين sfGFP والمنطقة الكروموسومالية محل الاهتمام لتعزيز وصلة الإدخال.
   1. اخلط 0.5 ميكرولتر من كل من محاليل البرايمر بسعة 10 ميكرومول ومستعمرة واحدة إلى حجم نهائي 12.5 ميكرولتر وقم بتغيير الشكل لمدة 10 دقائق عند 95 درجة مئوية. برد على الثلج لمدة 10 دقائق، أضف 12.5 ميكرولتر من محلول 2x PCR رئيسي، وقم بتحليل PCR.
2. ازرع بقعا ثقيلة من المستعمرات المعزولة على صفائح CYE-agar-Streptomycin لمدة يومين عند 37 درجة مئوية. افحص مستويات التعبير واستقرار اندماجات sfGFP عن طريق التطهير المناعي بجسم مضاد مضاد GFP.

3. تصوير الخلايا الحية لسيلاستريفون الرئة مع مكونات نقطية/ICM موسومة فلورية

1. تحضير وسادات الأغاروز
   1. اصنع حوالي 30 مل من محلول أجاروز منخفض الذوبان بنسبة 1٪ في الماء. أضعها في قارورة زجاجية لمدة حوالي 90 ثانية، مع الدوران أحيانا، حتى يذوب الأغاروز تماما.
   2. ضع منزلقين زجاجيين بحجم 22 × 22 × 0.15 مم³ زجاج على حافة شريحة زجاجية بحجم 25 × 75 × 1.1 مم³ ، واحدة فوق الأخرى. تكدس منزلقين زجاجيين آخرين بحجم 22 × 22 × 0.15 مم³ زجاج على الحافة الأخرى.
   3. قم بقطع حوالي 1 مل من الأجاروز المنصهر إلى السلايد المركزي بين الشريحتين الزجاجيتين العلويين، ثم ضع شريحة أخرى بحجم 25 × 75 × 1.1 مم³ على سطح الأغاروز المنصهر. حاول تجنب تكون فقاعات الهواء. برد الزلاجات على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
   4. باستخدام مشرط أو شفرة حلاقة، اقطع الوسادة بلطف إلى مربعات صغيرة، ~5 × 5 مم². ثبت إطار لاصق مزدوج الجوانب بمقاس 17 × 28 × 0.25 مم³ على شريحة زجاجية بحجم 25 × 75 × 1.1 مم³ مم وضع عدة وسادات على الشريحة.
2. الحصول على الصور
   ملاحظة: تم وصف الخطوات التالية لمجهر تحت سيطرة SlideBook 6.0 ومزود بإضاءة الحالة الصلبة، وكاميرا CCD أحادية اللون، وعدسة موضوعية 100x (فتحة عدسة رقمية 1.4). إذا لزم الأمر، استخدم أجهزة مجهر بديلة ذات تكوينات مادية وبرمجية مناسبة يمكن تخصيصها وفقا لإعدادات البروتوكول.
   1. إذابة بقعة ثقيلة من L. pneumophila في 1 مل من DDH₂O، والدوامة والماصة 2–3 ميكرولتر من التخفيف على الوسادات. ضع غطاء⁵⁰ × 24 × 0.15 مم 3 غطاء بلطف فوق الإطار اللاصق.
   2. في نافذة الالتقاط قم بضبط ND إلى 180. اضبط التوزيع على 2×2 واستخدم قناة 488 نانومتر لتعريض العينة بين 500–1000 مللي ثانية. تحقق من خصوصية إشارة التألق من خلال تصوير L . pneumophila غير الموسوم بنفس المعايير (الشكل 3).

النتائج

الشكل 1: نظرة مخططة لإعادة التركيب المتماثل والتبادل الأليلي المستخدم لإدخال sfGFP في كروموسوم L. pneumophila.(أ) تم إجراء التزاوج الثلاثي بين سلالة مساعدة من إشريكية قولونية MT616 تحتوي على البلازمي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
هدف خطة أبو 100x (1.4 NA)	نيكون
الآسات	سيغما-ألدرتش	A9758
الفحم النشط	سيغما-ألدرتش	C5510
أغاروز GPG/LMP، ذوبان منخفض	التحليل الحيوي الأمريكي	AB00981
الأجار المجفف بسمك البكتو	BD	214010
إطار الجين، 1.7x2.8 سم، 125 ميكرولتر	فيشر ساينتيفك	AB-0578
إل-سيستين	سيغما-ألدرتش	C7352
شرائح غطاء المجهر بحجم 22x22 مم	فيشر ساينتيفك	12-542B
شرائح غطاء المجهر بحجم 24x50 مم	فيشر ساينتيفك	12-545K
شرائح المجهر بحجم 25x75x1 مم	غلوب ساينتفيك	1380
سلايدبوك 6.0	ابتكارات التصوير الذكي
محرك الضوء سبيكترا إكس	لومينكور
تاك 2X ماستر ميكس	مختبرات نيو إنجلاند البيولوجية	M0270
تايتان كريوس	ثيرمو فيشر العلمي
مستخلص الخميرة	BD	212750