تأسيس نموذج فأر لعدوى كلوستريديوم ديفيسيل

الملخص

المصدر: وينستون، ج. أ. وآخرون. نموذج الفأر المعالج بالسيفيبرازون لسلالة كلوستريديوم ديفيسيل R20291 ذات الصلة سريريا. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو إجراء تطعيم الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية بأبواغ كلستريديوم ديفيسيل لإنشاء نموذج فأر للعدوى لدراسة المرض واستجابات المضيف.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.

1. تحضير لقاح الأبواغ من كلستريديوم ديفيسيل وجرع الفم للفئران

ملاحظة: يجب أن تؤوى الفئران التي تعاني من أبواغ C. difficile في منشأة حيوانية من المستوى 2 للسلامة البيولوجية.

1. احصل على مخزون C . difficile من السلالة المطلوبة (في هذه الحالة، R20291) تم تحضيره وتخزينه عند 4 درجات مئوية في مياه معقمة. حدد تعداد مخزون هذه الأبواغ قبل الاستخدام.
2. استنادا إلى التركيز المعروف (الأبواغ/مل) لمخزون الأبواغ، احسب التخفيف المطلوب للحصول على 10⁵ أبواغ لكل 25 ميكرولتر. التأكد من أن حجم اللقاح كاف لتحصيح جميع الفئران في التجربة (25 ميكرولتر لكل فأر)، وإجراء تعداد اللقاح (حوالي 30 ميكرولتر)، وأخذ خطأ في التوصيل بالماصات في الاعتبار.
3. دوامة من مخزون الأبواغ الأصلي في C. difficile . ثم أعد تعليق الحجم المحسوب (من الخطوة 1.2) لمخزون أبواغ C. difficile الأصلي في ماء معقم داخل أنبوب طرد مركزي دقيق مغلف بمسمار. قم بذلك بشكل هوائي باستخدام غطاء تدفق طبقي. حدد هذا الخليط المخفف على أنه "لقاح الأبواغ".
4. ضع لقاح الأبواغ في حمام ماء بدرجة حرارة 65 درجة مئوية وسخنه لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: ستضمن هذه الخطوة بقاء أبواغ C. difficile النشطة فقط بعد المعالجة الحرارية.
5. داخل غطاء التدفق الطبقي، خذ 50 ميكرولتر من لقاح الأبواغ المسخن، وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم، ومرره إلى الغرفة اللاهوائية. استخدم هذه العينة لتعداد الأبواغ.
6. داخل غطاء التدفق الطبقي، قم بتحميل لقاح الأبواغ المسخن المتبقي في حقنة بسعة 1 مل متصلة بإبرة معقمة ذات رأس مصباحي. استخدم أداة معالجة الحقنة اليدوية لضمان تكرار الجرعات الدقيق والسريع بين الفئران. تأكد من ملء إبرة الجافاج باللقاح الساخن قبل الاستخدام.
   ملاحظة: لا يلزم وجود إبرة جافاج معقمة جديدة لكل فأر. ومع ذلك، إذا تم إعطاء جرعات مختلفة من أبواغ C. difficile ، يوصى باستخدام إبرة جافيج جديدة لكل جرعة.
   ملاحظة: أبواغ C. difficile مقاومة جدا للمطهرات التقليدية. لذلك، من الضروري استخدام مطهر إسبويريسيد، مثل #62 Peresept Sporicidal Plapestant. توصي الشركة المصنعة ب 2 دقيقة تلامس لتدمير أبواغ C. difficile .
7. قم بإعطاء كل فأر 25 ميكرولتر من لقاح الأبواغ. قيد كل فأر بلطف عن طريق الإمساك بالحيوان من الجلد الفضفاض للرقبة والظهر لتثبيت الرأس. استخدام الإصبع السبابة يزيد من تثبيت حركة رأس الحيوان ولإطالة المريء. تأكد من أن الحيوان لا يصدر أصواتا أو يظهر علامات أخرى على الضيق أثناء التقييد.
   ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الكلي الذي يمنحه الجريء للفئران 10 مل/كجم من وزن الجسم (0.1 مل/10 جم).
8. حافظ على الفأر في وضع عمودي ومستقيم ومرر إبرة الغاج بلطف إلى جانب الفم. وجه إبرة الغافاج على طول سقف الفم ودفع إبرة الغافاج ببطء إلى المريء.
   ملاحظة: إذا واجهت أي مقاومة، قد تدخل إبرة الجافاج إلى القصبة الهوائية، وبالتالي لا يجب أن تتقدم للأمام، بل تزال وتعاد وضعها فورا.
9. بعد أن تصل إبرة الجافاج إلى منتصف المريء تقريبا، حقن 25 ميكرولتر من لقاح البوغ الساخن واسحب إبرة الغاج بلطف من المريء.
   ملاحظة: قد يؤدي التقدم القوي لإبرة الغافاج إلى تمزق المريء أو المعدة. لذلك، إذا واجهت مقاومة عند دفع إبرة الجافاج، من الأفضل إزالة وإبرة الغافيج فورا وإعادة وضعها.
10. أعد الحيوان إلى قفصه وراقبه بحثا عن أي سعال أو علامات ضيق تنفسي، حيث قد يشير ذلك إلى إعطاء القصبة الهوائية غير المقصود أو استنشاق لقاح الأبواغ الساخن.
    ملاحظة: الفئران شديدة الحساسية لعدوى C. difficile بعد العلاج بالمضادات الحيوية؛ لذلك، فإن اتخاذ الاحتياطات لمنع التلوث المتبادل بين الأقفاص أمر ضروري. وهذا مهم بشكل خاص عند إدارة الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ولكن غير المتنازعة عليها كعوامل ضبط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
#62 منظف تعقيم سبوريديال من نوع بريسيبت	SSS Navigator	48027	هذا المنتج سيحتاج إلى تخفيف كما أوصى به المصنع
فئران C57BL/6J	مختبر جاكسون	664	يجب أن يكون عمر الفئران من 5 إلى 8 أسابيع
غطاء برغي الطرد المركزي الدقيق بسعة 2 مل	كورنينغ	430917