$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بنماذج الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية ومجلس مراجعة الطب البيطري في JoVE.
- الحصول على عينات لتعداد كلستريديوم ديفيسيل (C. difficile)
ملاحظة: قبل الحصول على البراز أو محتوى السيكل، قم بوزن أنابيب الطرد المركزي الدقيق المعقمة على مقياس تحليلي. سجل وزن الأنبوب على جانب الأنبوب، مع تقريب إلى أربعة مخارج عشرية (مثلا، 0.9864 جم). رمز هذا الوزن ك "وزن الأنبوب". يجب وضع كل عينة يتم جمعها في أنبوب طرد مركزي دقيق ومثقل بوزن.
1. مجموعة معقمة من فضلات الفئران- قيد كل فأر بلطف بالإمساك بالجلد الفضفاض للرقبة والظهر لتثبيت الرأس. استخدم الإصبع الصغير لتقييد ذيل الحيوان بلطف، مما يكشف عن فتحة الشرج. تأكد من أن الحيوان لا يصدر أصواتا أو يظهر علامات أخرى على الضيق أثناء التقييد.
- أمسك أنبوب طرد مركزي دقيق ومثقل مباشرة تحت فتحة شرج الحيوان. من الضروري ألا يلامس الأنبوب الفأرة مباشرة.
- أثناء تبرز الحيوان، اجمع الحبيبات البرازية داخل الأنبوب. حافظ على الأنبوب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم جمع جميع عينات البراز. قد يستغرق الفأر عدة دقائق للتبرز، مما يستلزم محاولات متكررة لجمع البراز.
- وزن الأنابيب التي تحتوي على البراز على الميزان التحليلي. سجل وزن الأنبوب، مع تقريب إلى أربعة مخارج عشرية (مثلا، 1.0021 جم). ارمز إلى الوزن الذي تم الحصول عليه ك "الوزن النهائي للأنبوب".
- مرر عينات البراز إلى الحجرة اللاهوائية لإجراء تعداد البكتيريا مباشرة بعد جمع البراز.
- التعداد البكتيري لكورديا ديفيسيل
- احسب الوزن النهائي للمحتويات (البراز) التي سيتم تعدادها ل C. difficile. تم ذلك عن طريق طرح "الوزن النهائي للأنابيب" من "وزن الأنبوب".
- احسب تخفيفا بنسبة 1:10 للمحتويات إلى محلول ملحي مخزن فوسفات 1X (PBS) وأعد تعليقه وفقا لذلك. بالنسبة لحبيبات البراز، استخدم طرف الماصة لتعطيل الحبيبة بلطف حتى تتحول إلى المحلول.
- حضن هذه العينات المعلقة بشكل لاهوائي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، مما يسمح باستقرار المحتويات.
- قم بتخفيفات تسلسلية لكل عينة في 1x PBS لتعداد وحدات تكوين المستعمرة (CFU) لكل جرام من المحتوى (البراز). قم بذلك بشكل لا هوائي.
- باستخدام تقنية المعقم، نقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي إلى ألواح سيفوكسيتين فركتوز أجار (TCCFA) من التاوروكولات سيفوكسيتين. باستخدام موزع معقم على شكل حرف L، انشر التخفيف المطبق على الوسط لتوزيعه بالتساوي عبر اللوحة. حتى انتشار التخفيف ضروري لتعداد المستعمرات بدقة.
- حضن الصفائح بشكل لاهوائي لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. في هذا الوقت، قم بتعداد مستعمرات C. difficile للحصول على CFU لكل جرام من المحتوى (البراز). مستعمرات C. difficile مسطحة وصفراء فاتحة ولها حواف غير منتظمة ومظهر زجاجي مصحوب.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لتعداد C. difficile من محتوى آخر في الفأر المعوي (GI)، بما في ذلك محتوى اللفائفي والقولون. يمكن استخدام ألواح تفاعل البوليمراز المتسلسل (PCR) لصنع التخفيف التسلسلي.