اختبار قائم على الفلورة لدراسة تفاعلات مستقبلات البلاعم مع المستضدات البكتيرية

الملخص

المصدر: باربيرو، أ. م.، et.al. تحاليل الفلورة لدراسة تفاعل الفطر السلي مع مستقبل المناعة SLAMF1. J. Vis. Exp. ((2025)

يوضح هذا الفيديو اختبارا قائما على الفلورة لدراسة التفاعل بين مستقبل البلاعم ومستضدات متفطرة السل . يتم حضن المستضدات الموسومة بالفلورية على غطاء الغطاء مع مستخلصات بروتين البلاعمية، ومرتبطة بالأجسام المضادة، ويتم رؤيتها من خلال إشارات فلورية متداخلة.

البروتوكول

1. تفاعل متفطرة السل - SLAMF1 بواسطة المجهر الفلوري

1. الربط المتقاطع بين البكتيريا والبروتين
   1. إدخال أغطية دائرية بقطر 12 مم في ألواح زراعة 24 بئر (غطاء واحد لكل بئر) باستخدام ملاقط جراحية ذات أنف مستدير.
      ملاحظة: نظف الأغطية جيدا بنسبة 70٪ إيثانول. إذا رغبت، يمكن تعقيم أو تعقيم تحت ضوء UV لمدة 30 دقيقة.
   2. حضن الغطاء ب 400 ميكرولتر من بولي-دي-ليسين 10 ميكروغرام/مل طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. غط اللوح بورق الألمنيوم لحمايته من الضوء.
   3. في اليوم التالي، أخرج الطبق من الثلاجة واغسل غطاء الغطاء مرتين بسعة 1 مل من الماء.
   4. دع الغطاء يجف.
   5. قم بتخفيف 20 ميكرولتر (2 ×^{10 6}) من Mtb-R Ags في 180 ميكرولتر من 1x PBS. ال 200 ميكرولتر النهائية تكفي لتغطية غطاء كامل للسحب.
   6. حضن الغطاء باستخدام Mtb-R Ags لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة الخلايا.
   7. تخلص من السائل المتبقي واغسل مرتين ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS).
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن التحقق من الالتصاق الصحيح ل Mtb-R بالغطاء بواسطة مجهر فلوري باستخدام المرشحات المقابلة للقناة الحمراء.
   8. أضف 400 ميكرولتر من محلول العزل (10٪ مصل بقري جنيني (FBS)) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 30 دقيقة عند RT في حالة التحريك (هزاز).
   9. اغسله مرتين باستخدام 400 ميكرولتر من حاجز الحاجز.
   10. حضن ب 100 ميكرولتر من مستخلص البروتين المخفف في 300 ميكرولتر من 1x PBS لمدة ساعتين عند RT في التحريك (الهزاز).
   11. أضف 400 ميكرولتر من الفورمالديهيد بنسبة 1٪ مخفف بمقدار 1x PBS. حضن لمدة 15 دقيقة تحت التحريك (الهزاز) في RT.
   12. أضف 500 ميكرولتر من الجليسين بوزن 0.125 مولار مخفف في الماء. حضن لمدة 5 دقائق تحت التحريك (الهزاز) عند RT.
   13. اغسل مرتين ب 1 مل من 1x PBS.
   14. أضف 400 ميكرولتر من 2 ملليمويل إيثيلين غليكول بيس (سوكسنيميديل سوكسيكسينات) (EGS لمدة ساعة واحدة عند RT في التحريك (الهزاز).
   15. كرر الخطوة 1.1.13
       ملاحظة: ينصح بشدة بتحضير الكواشف وقت الاستخدام.
2. صبغة SLAMF1
   1. لف غطاء لوحة الزراعة بطبقة من البارافين.
   2. أضف قطرة 60 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المضاد ل SLAMF1 الذي تم تعديله سابقا (تخفيف بنسبة 1:75) على الغطاء المغطى بأغشية البارافين.
   3. قم بإزالة غطاء الغطاء بعناية من اللوحة باستخدام ملقط جراحي منحني ذو طرف دقيق وعلى الطرف.
      ملاحظة: لتسهيل إزالة الانزلاق الداخلي، يمكن ثني الإبرة بزاوية تقريبية 45°.
   4. اقلب غطاء الغطاء فوق القطرة التي تحتوي على الجسم المضاد. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
   5. ارفع غطاء الغطاء واغسل مرتين باستخدام مخزن الحاجز.
   6. اقلب غطاء الغطاء فوق قطرة جديدة تحتوي على الجسم المضاد الثانوي (تخفيف 1:200). احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
   7. كرر الخطوة 1.2.5.
   8. قم بإزالة السائل الزائد وركب غطاء الغطاء على قطرة من سائل التثبيت موضوعة على شريحة زجاجية.
   9. راقب تحت المجهر الفلوري باستخدام مرشحات مناسبة.
      ملاحظة: ينصح بالعمل في ظروف معقمة. قم بتخفيف الأجسام المضادة في المخزن المانع. تعامل مع غطاء الغطاء بعناية لتجنب الخدوش التي قد تعيق المراقبة تحت المجهر. ينصح بشدة باستخدام سائل تركيب مناسب للفلورة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الجسم المضاد الثانوي أليكسا فلور 488	إنفيتروجين	A21121	بالنسبة للمجهر الفلوري
الجسم المضاد الأساسي لمضاد SLAMF1	بيو ليجند	306302	بالنسبة للمجهر الفلوري
أكوا-بولي/ماونت	العلوم متعددة	18606-20	وسائط التركيب
أغطية 12 مم	HDA	-	لاختبار التفاعل بالمجهر
EGS	ثيرموفيشر ساينتيفيك	21565	لعلاج الربط المتقاطع
الفورمالديهايد	ميرك	K47740803613	لعلاج الربط المتقاطع
شرائح زجاجية	زجاج كلاس	-	لاختبار التفاعل بالمجهر
الجلايسين	سيغما	G8898	لعلاج الربط المتقاطع
Imager.A2	كارل زايس	430005-9901-000	مجهر الفلورية مع وحدة إضاءة كوليبري 7
بولي-دي-ليسين	سيغما ألدريتش	A-003-M	لعلاج الغطاء
رودامين ب	سيغما ألدريتش	21955	بالنسبة ل م. صبغة السل