تطوير نموذج عدوى يرقات سمك الزرد باستخدام Microgavage

الملخص

المصدر: لي، ج. وآخرون. تطوير نموذج لعدوى يرقات سمك الزرد لكلوستريديويديس ديفيسيل. ج. فيس. إكسب. (2020).

يوضح هذا الفيديو إجراء الميكروغافاج، حيث يتم تثبيت يرقة سمك الزرد المخدرة في أغاروز وحقنها عن طريق الفم ببكتيريا ممرضة باستخدام إبرة موجهة بجهاز التتبع. يحاكي هذا التوصيل غير الجراحي العدوى الطبيعية، مما يمكن من تحليل تكاثر البكتيريا، وإفراز السموم، وتلف الظهارة المعوية.

البروتوكول

1. غافاج يرقات سمك الزرد

1. قم بمعايرة إبرة الميكروغافاج.
2. قس قطر طرف الإبرة بوضع الإبرة على شريحة معايرة بقطرة واحدة من الزيت المعدني. تأكد من أن الطرف قطره بين 30–40 ميكرومتر، غير حاد وناعم. تخلص من الإبر الحادة أو الخشنة.
   ملاحظة: يمكن تخفيف الحواف الحادة للإبر بواسطة اللهب السريع.
3. حضر محلول الجافاج.
4. قم بتحميل وتركيب الإبرة على جهاز تحكم دقيق.
5. اضبط الميكرو مانبيولاتور لوضع الإبرة بزاوية 45°.
6. قم بتخدير يرقات سمك الزرد. عندما تتوقف اليرقات عن الحركة، انقلها إلى أخدود قالب ميكروجافاج باستخدام ماصحة باستور.
7. ضع قطرة من أجاروز منخفضة الذوبان بنسبة 0.8٪ على يرقات سمك الزرد لتغطيتها. عدل اليرقات بلطف بحيث تكون رؤوسها متجهة للوضع العمودي بزاوية 45° في الأخدود والذيل على جدار الأخدود. تأكد من أن زوايا الرؤوس متقاربة تقريبا بحيث تتوافق مع زاوية إبر الجافاج. ضع قالب الميكروغافاج على الجليد لمدة 30–60 ثانية، مما يسمح للأجاروز منخفض الانصهار بالتصلب لتثبيت مواقع اليرقات.
8. اضبط ضغط الحقن بين 200–300 هكتوباسكال. اضبط وقت الحقن إلى 0.1–0.3 ثانية للحصول على حجم حقن 3–5 نانولتر من كلوستريديويديس ديفيسيلي.
9. قم بتشغيل الإبرة بلطف عبر الأغاروز، ثم إلى فم يرقات سمك الزرد، ثم عبر المريء. بمجرد أن يكون طرف الإبرة داخل البصلة الأمامية للأمعاء، اضغط على دواسة الحقن لتحرير البكتيريا. املأ تلوين الأمعاء بالحجم الموصول بالضبط. لا تدعه يفيض من المريء أو الفتحة. اسحب الإبرة برفق من فم سمكة الزرد.
10. بعد الغافاج، يتم إنقاذ يرقات سمك الزرد المصابة من الأجاروز باستخدام طرف مرن بمحمل دقيق عن طريق قطع الأجاروز أولا ثم رفع اليرقات. انقل هذه اليرقات إلى وسط دانياو المعقم بنسبة 30٪. اشطف اليرقات في وسط معقم مرتين. انقل اليرقات إلى طبق بترى طازج بحجم 10 سم. سيتم الحفاظ على اليرقات لمدة تصل إلى 11 يوما بعد الإخصاب (DPF).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغاروز	سيغما-ألدرتش	A2576	أغاروز التلاميذ المنخفض جدا
الانصهار منخفض الأغاروز (LM)	بروناديسا	8050	يستخدم في صفائح الأجاروز
الزجاج الشعري	جهاز هارفارد	30-0019	إبر الحقن
كلوستريديوديس ديفيسيلي			R20291، سلالة ريبوتايب 027، إنتاج TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	كارل روث GmbH	A994
فيجي	منصة مفتوحة المصدر		معالجة الصور
هيبس	كارل روث GmbH	6763
أداة سحب الإبر الأفقية	شركة ساتر إنسترومنت إنك	P-87
إل-سيستين	سيغما-ألدرتش	168149
لايكا Application Suite X (LAS X)	لايكا		معالجة الصور
الحقن الدقيق	إبندورف	5253000017
قوالب الحقن الدقيق	أدوات العلوم التكيفية	TU1
مجهر لايكا SP8 الكونفوكال	لايكا
فينول ريد	سيغما-ألدرتش	P0290
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	كارل روث GmbH	5346
كلوريد الصوديوم (NaCl)	كارل روث GmbH	9265
الثوروكولات	كارل روث GmbH	8149
تريكائين	سيغما-ألدرتش	E10521
مستخلص الخميرة	بي دي باكتو	212750