تلقيح ممرض بكتيريا في أوراق الأرابيدوبسيس عبر تسرب الفراغ

الملخص

المصدر: روفيان، ج. س.، et.al. تحليل خلية واحدة لتعبير جينات Pseudomonas syringae داخل نسيج النبات. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة تسرب بالتفريغ لإدخال ممرض بكتيري في أوراق نبات الأرابيدوبسيس . يستخدم هذا النهج تعليق بكتيري محضر ونبضات فراغية لتمكين دخول منتظم عبر الثغر، مما يؤدي إلى السيطرة على عدوى الأوراق.

البروتوكول

1. تلقيح نباتات الأرابيدوبسيس

ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام سلالات Pseudomonas syringae pv. طماطم DC3000 و P. syringae pv. تم استخدام فايزيوليكولا 1448A.

1. جهز لقاح P. syringae .
   1. اخرج سلالة P. syringae محل الاهتمام من مخزون الجلسرول بحجم −80 درجة مئوية على صفيحة LB (10 جم/لتر تريبتون، 5 جرام/لتر NaCl، 5 جرام/لتر مستخلص الخميرة، و16 جرام/لتر أجار البكتيريولوجي) مع إضافة المضادات الحيوية المناسبة. حضن عند 28 درجة مئوية لمدة 40-48 ساعة.
      ملاحظة: يوصى باستخدام المضادات الحيوية إذا كانت السلالة المعنية تحمل البلازميد أو جين مقاومة جينومية. تركيزات المضادات الحيوية الموصى بها ل P. syringae هي كما يلي: كاناميسين (15 ميكروغرام/مل)، جنتامايسين (10 ميكروغرام/مل)، أمبيسيلين (300 ميكروغرام/مل).
   2. قم بكشط الكتلة الحيوية البكتيرية وأعد تعليقها بسعة 5 مل من 10 ملليمولار MgCl₂. قس OD₆₀₀ وضبط إلى 0.1 بإضافة 10 مللي مولار MgCl₂.
      ملاحظة: كمية OD₆₀₀ من 0.1 من مزرعة P. syringae تتوافق مع 5 × 10⁷ CFU^·mL−1.
   3. قم بتخفيفات تسلسلية إلى 10 مللي مولار MgCl₂ للوصول إلى تركيز اللقاح النهائي 5 × 10⁵ CFU^·mL−1. جهز 200 مل من اللقاح لنباتات الأرابيدوبسيس .
   4. قبل التطعيم مباشرة، أضف مادة المضاف السطحي سيلويت L-77 إلى تركيز نهائي 0.01٪ للأرابيدوبسيس. لاحظ أن سيلويت يضر إلى حد ما بنسيج الأرابيدوبسيس .
2. قم بتسرب الفراغ.
   1. لتسلل الأرابيدوبسيس، ضع عصاي خشب يشكلان حرف X فوق الوعاء (الشكل 1E)، وضع الوعاء مواجها للأسفل فوق طبق بترى قطره 14 سم يحتوي على اللقاح بسمك 200 مل (الشكل 1F).
   2. أدخل النباتات المغمورة في محلول اللقاح في غرفة تفريغ (الشكل 1G) وأعط نبضة 500 ملي بار لمدة 30 ثانية لتتسلل إلى الأوراق. كرر نبضة الفراغ 2-3 مرات حتى يتم اختراق الورقة بالكامل (الشكل 1H).
   3. قم بتصريف محلول اللقاح الزائد بورقة وأعد النباتات إلى غرفة النمو المقابلة لها.

النتائج

الشكل 1: التلقيح البكتيري واستخراج الأبوبلاست باستخدام نباتات الأرابيدوبسيس . (أ) تحضير الوعاء مع تثبيت الشبكة المعدنية بشكل صحيح. (ب) زرع البذور باستخدام عود أسنان لتوزيعها كما هو موضح في (...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أطباق بتري بقياس 140 مم			لا توجد متطلبات خاصة
الأجار البكتيري	روكو
جنتامايسين كبريتات	دوشيفا	G-0124
مونوسلفات الكاناميسين	التقنية النباتية	K378
MgCl₂	ميرك
NaCl	ميرك
سيلويت L-77	شركة كرومتون أوروبا المحدودة
التريبتون	ميرك
غرفة التفريغ بقطر 25 سم	كارتيل	554
مضخة التفريغ	GAST	DOA-P504-BN
مستخلص الخميرة	ميرك
الصوديوم الأمبيسيلين	جولد بيو