التصوير عالي الإنتاجية لعدوى البروسيلا الإجهاضية داخل الخلايا في خلايا ظهاري المضيف

الملخص

المصدر: كازانوفا، أ.، وآخرون. اختبارات المجهرية لفحص العوامل المضيفة المتورطة في عدوى بروسيللا لخلايا هيلا عالية الإنتاجية. J. Vis. Exp. (2016)

يظهر هذا الفيديو تصويرا عالي الإنتاجية لعدوى بروسيلا إبورتوس في الخلايا الطهارية مع تقليل STING بوساطة siRNA لدراسة دور استشعار الحمض النووي الخلوي في تكاثر البكتيريا داخل الخلية والاستجابة المناعية الفطرية للمضيف.

البروتوكول

1. العدوى والتثبيت

1. قبل يوم واحد من العدوى، قم بتلقيح الكمية المحددة من مزرعة B . abortus في وسط 50 مل TSB/Km (مرق الصويا التريبتي يحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين) في زجاجة بسعة 250 مل ذات غطاء لولبي. أغلق الزجاجة بطبقة بارافيلم وازرع البكتيريا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و100 دورة في الدقيقة على هزاز مداري حتى OD₆₀₀ = 0.8-1.1.
2. قم بقياس جرعة_{الأكسجين 600} من الزراعة البكتيرية وتحضير وسط العدوى عن طريق تخفيف الزراعة البكتيرية في DMEM (وسط النسر المعدل في دولبيكو) / 10٪ FCS (مصل العجل الجنيني) لتحقيق تعدد العدوى المطلوب (MOI).
   ملاحظة: للحصول على معدل عدوى يتراوح بين 5-10٪ في خلايا HeLa، يستخدم MOI يبلغ 10,000. يجب إجراء منحنى معايرة MOI لكل نوع من الخلايا للحصول على معدلات عدوى مثالية.
3. استبدل وسط النقل في صفيحة 384 بئر مع 50 ميكرولتر من وسط العدوى باستخدام غسالة ألواح آلية.
4. قم بعمل الطرد المركزي على لوحة 384 بئر عند 400 × جرام و4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: يساعد ذلك على مزامنة عملية العدوى.
5. أغلق اللوح بفيلم بارافيلم ويحتضنه على لوح ألمنيوم مدفأ مسبقا في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{لمدة 4} ساعات.
6. اغسل الخلايا باستخدام DMEM/10٪ FCS يحتوي على 100 ميكروغرام/مل جرام (جنتاميسين) لتعطيل البكتيريا خارج الخلية باستخدام غسالة الألواح الأوتوماتيكية (استخدم غسيل 200 ميكرولتر/تدفق البئر).
   ملاحظة: أثناء غسل الفائض، يقوم جهاز غسل الألواح الآلي بتوزيع وسحب الوسط في الوقت نفسه.
7. لاختبار الدخول، غسل خلايا السحب مرة ثانية باستخدام DMEM/10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام/مل جرام و100 نانوغرام/مل aTc باستخدام غسالة الألواح الأوتوماتيكية (استخدم غسيل 200 ميكرولتر/فائض البئر).
8. قم بإغلاق اللوح بفيلم بارافيلم وأعده إلى لوحة ألمنيوم مدفأة مسبقا في الحاضنة الرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_لمدة 40 ساعة أو 4 ساعات أخرى، لاختبار نقطة النهاية واختبار الدخول على التوالي.
9. للتثبيت، اغسل الآبار باستخدام PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) باستخدام غسالة الألواح الآلية (استخدم غسيل 200 ميكرولتر لكل بئر فائض).
10. استبدل PBS مع 50 ميكرولتر 3.7٪ بارافورمالديهايد (PFA) في HEPES بعمق 0.2 متر عند pH 7.4 باستخدام جهاز غسل الألواح الآلي.
    ملاحظة: تحذير: PFA سام عن طريق الاستنشاق، عند ملامسة الجلد، وإذا تم ابتلاعه.
11. حضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. استبدل وسط التثبيت بسعة 50 ميكرولتر PBS باستخدام غسالة الألواح الأوتوماتيكية.
    ملاحظة: العينات الآن جاهزة لإخراجها من BSL3 إذا لزم الأمر.
    تحذير: تخضع إزالة أي عينة من منشأة المستوى 3 للسلامة البيولوجية (BSL3) لتقييم المخاطر والتحقق من الإجراء، وتعتمد على اللوائح المعمول بها للسلامة البيولوجية.

2. التلوين

1. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 50 ميكرولتر PBS.
2. نفي الخلايا في 50 ميكرولتر بنسبة 0.1٪ تريتون-X-100 في PBS لمدة 10 دقائق.
3. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 20 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على 1 ميكروغرام/مل DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) وحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS واحمي التصبغ من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق الصويا التربتيكي (TSB)	فلوكا	22092
كبريتات الكاناميسين	سيغما-ألدرتش	60615
زجاجة غطاء لولبي بسعة 250 مل	كورنينغ	8396
DMEM	سيغما-ألدرتش	D5796
مصل العجل الجنيني (FCS)	جيبكو	10270	معطل الحرارة
صفيحة جرينر سيلستار ذات 384 بئر	سيغما-ألدرتش	M2062
رقائق الألمنيوم القابلة للتقشير	Costar	6570
موزع الكواشف: "موزع كاشف القطرات المتعددة 384"	ثيرمو ساينتفيك	5840150	يمكن استخدام موزع كاشف بديل.
كاشف النقل: "ليبوفكتامين RNAiMAX	إنفيتروجين	13778-150
غسالة الألواح الآلية: "غسالة الألواح EL50-16"	BioTek	ELX5016	تحتوي هذه الغسالة على مشعب ب 16 قناة مناسب لألواح 384 بئر. يتناسب مع خزانة السلامة الحيوية ويحتوي على غطاء يغطي الطبق أثناء الغسيل مما يقلل من خطر إنتاج الهباء الجوي. يمكن استخدام غسالات ألواح بديلة ذات ميزات مشابهة.
جنتاميسين	سيغما-ألدرتش	G1397
PBS	جيبكو	20012
بارافورمالديهايد	سيغما-ألدرتش	P6148	تذوب في مخزن HEPES بعمق 0.2 متر، درجة حموضة 7.4. خزن عند -20 درجة مئوية وذيب الطعم طازجا في اليوم السابق للاستخدام. تحذير، PFA سام عن طريق الاستنشاق، عند ملامسة الجلد، وإذا تم ابتلاعه.
هيبس	سيغما-ألدرتش	H3375
ترايتون X-100	سيغما-ألدرتش	T9284
DAPI	روش	10236276001
Kif11 siRNA	دارماكون	L-003317-00
الحمض النووي الريبي المغناطيسي ARPC3	دارماكون	L-005284-00
بروسيلا إبورتوس 2308
هيلا CCL-2	ATCC	CCL-2
إيمج إكسبريس ميكرو	الأجهزة الجزيئية	مرصد تصوير IXM	مجهر تصوير خلوي آلي مزود بمرحلة Z دقيقة بمحركات. يمكن استخدام أنظمة بديلة للمجهر الآلي ومكونات بديلة للمجهر الصلب والبرمجيات المحددة أدناه.