الكشف عن حساسية المضادات الحيوية البكتيرية باستخدام مجهر رامان المحفز للتشتت

الملخص

المصدر: تشانغ، م. وآخرون، اختبار الحساسية السريعة لمضادات الميكروبات بواسطة تصوير تشتت رامان المحفز لدمج الديوتيريوم في بكتيريا واحدة. J. Vis. Exp. (2022)

يوضح هذا الفيديو تطبيق مجهر رامان المحفز للتشتت لتقييم القابلية للمضادات الحيوية من خلال تتبع النشاط الأيضي الموسوم بالديوتيريوم. من خلال مراقبة إشارات الكربون-ديوتيريوم، تتيح الطريقة الكشف السريع عن مجموعات البكتيريا المقاومة والمعرضة للتأثير.

البروتوكول

1. D₂O العلاج بالدمج في وجود المضادات الحيوية (الشكل 1أ)

1. تحقق من تركيز البكتيريا بقياس الكثافة الضوئية (OD) باستخدام فوتوميتر بطول موجي 600 نانومتر.
2. تخفيف المحلول البكتيري باستخدام وسط مرق مولر-هينتون (MHB) العادي، الذي لا يحتوي على الديوتيريوم، للوصول إلى تركيز خلوي نهائي يبلغ 8 × 10⁵ CFU/mL. استخدم فورتكس بلطف لخلط الخلايا البكتيرية.
3. تحضير 300 ميكرولتر من محلول البكتيري في سبعة أنابيب دقيقة بحجم 1.5 مل، و600 ميكرولتر من المحلول البكتيري في أنبوب ميكرو واحد بسعة 1.5 مل.
4. أضف 4.8 ميكرولتر من محلول المضاد الحيوي (جنتاميسين أو أموكسيسيلين) (1 ملغ/مل) إلى الأنبوب الدقيق الذي يحتوي على 600 ميكرولتر من المحلول البكتيري، ليصل التركيز النهائي للمضاد الحيوي إلى 8 ميكروغرام/مل.
5. خذ 300 ميكرولتر من المحلول من محلول بكتيريا يحتوي على 8 ميكروغرام/مل، وأضيف إلى 300 ميكرولتر أخرى من المحلول البكتيري، لإنتاج محلول بكتيريا مخفف مزدوجا (4 ميكروغرام/مل).
6. كرر التخفيف التسلسلي المزدوج للمضادات الحيوية للاختبار، جنتاميسين، أو أموكسيسيلين، حتى يتم الوصول إلى الأنبوب الدقيق ذو التركيز الأدنى (0.25 ميكروغرام/مل)، ثم تخلص من 300 ميكرولتر من الأنبوب. لكل من الجنتاميسين والأموكسيسيلين، تتراوح التركيزات التسلسلية بين 0.25 ميكروغرام/مل - 8 ميكروغرام/مل.
   1. اترك أنبوبا واحدا بدون مضادات حيوية ليتم التحكم فيه تماما. سيكون هذا هو الدليل الإيجابي لفحص النشاط الأيضي البكتيري دون علاج بالمضادات الحيوية ولكن مع علاج D_2O.
   2. اترك أنبوبا واحدا بدون مضادات حيوية وبدون_D2Oللسيطرة السلبية.
7. حضن البكتيريا مع مضاد حيوي معين (جنتاميسين أو أموكسيسيلين) يحتوي على وسط MHB لمدة ساعة واحدة.
8. أثناء الحضانة، جهز تخفيفا متسلسلا للمضادات الحيوية التي تحتوي على وسط يحتوي على D₂O بنسبة 100٪ مع نفس تدرج تركيز المضادات الحيوية المحضرة في الخطوة 1.6. لكل من الجنتاميسين والأموكسيسيلين، تتراوح التركيزات التسلسلية بين 0.25 ميكروغرام/مل - 8 ميكروغرام/مل.
9. بعد ساعة من العلاج بالمضاد الحيوي، أضف 700 ميكرولتر من المضاد الحيوي المخفف بشكل متسلسل ومتوسط MHB يحتوي على D₂O، إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا المعالجة بالمضادات الحيوية بنفس تركيز المضاد الحيوي (المعد في الخطوة 1.6)، على التوالي.
   1. على سبيل المثال، أضف 700 ميكرولتر من وسط MHB يحتوي على D₂OX بنسبة 100٪ (يحتوي على 8 ميكروغرام/مل من المضاد الحيوي) إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا المعالجة مسبقا بالمضادات الحيوية بحجم 8 ميكروغرام/مل. بنفس الطريقة، ينتقل إلى الأنابيب المقابلة للتركيز التالي، ثم يشكل التجانس عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا عدة مرات.
   2. أضف 700 ميكرولتر من وسط MHB الخالي من المضادات الحيوية 100٪ يحتوي على D₂O، إلى 300 ميكرولتر من البكتيريا الخالية من المضادات الحيوية (المحضرة في الخطوة 1.6.1) كمادة تحكم فارغة.
   3. احتضن عند 37 درجة مئوية في جهاز حضانة عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، يكون التركيز النهائي ل D₂O في الوسط للاختبار 70٪.
10. أولا قم بالطرد المركزي بكمية 1 مل من المضاد الحيوي وعينة بكتيريا معالجة ب D₂O بحرارة 6200 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، ثم اغسلها مرتين بماء منقى. وأخيرا، ثبت العينات في محلول فورمالين 10٪ وخزنها عند 4 درجات مئوية.

2. تصوير تشتت رامان المحفز (SRS) لدمج الأيض_D2O في بكتيريا واحدة

1. اغسل 1 مل من محلول البكتيريا الثابت بماء منقي ثم استخدم الطرد المركزي على حرارة 6200 x g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أزل السوبرناتينت. قم بإثراء المحلول البكتيري إلى حوالي 20 ميكرولتر.
2. وضع المحلول البكتيري على زجاج مغلف بطبقة من البولي-إل-ليسين. ضع العينة في الساندويتش وأغلق التصوير لفحص SRS.
3. صور البكتيريا عند تردد اهتزاز C-D عند 2168 سم-1 باستخدام مجهر SRS.
   1. إدخال وضبط طول موجة المضخة إلى 852 نانومتر باستخدام برنامج التحكم في الكمبيوتر.
   2. قس طاقة الليزر باستخدام مقياس الطاقة. اضبط قدرة ليزر المضخة عند العينة إلى ~8 ميغاوات وقدرة ليزر ستوكس عند العينة إلى ~40 مللي واط عن طريق ضبط لوحة نصف الموجة أمام خرج الليزر.
      ملاحظة: في مجهر SRS، يوفر ليزر فيمتوثانية قابل للضبط بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز ليزري الإثارة المضخة (680 إلى 1300 نانومتر) وستوكس (1045 نانومتر).
4. عن طريق ضبط براغي مرايا الانعكاس، قم بمحاذاة المضخة وشعاعي ستوكس مكانيا وتوجيه الشعاعين إلى مجهر قائم مزود بنظام مرآة جالفو ثنائية الأبعاد للمسح بالليزر.
   1. استخدم هدف غمر ماء بمقدار 60x لتركيز المضخة وليزر ستوكس على العينة.
   2. استخدم مكثف زيت لجمع الإشارات من العينة في الاتجاه الأمامي.
   3. استخدم فلتر تمرير النطاق لتصفية ليزر ستوكس قبل توجيهه إلى الفوتوديود.
   4. استخرج إشارة رامان المحفزة بواسطة مضخم قفل وكشف الإشارات بواسطة فوتوديود.
5. قم بتعيين كل صورة SRS لتحتوي على 200 × 200 بكسل ووقت البكسل ليكون 30 ميكروثانية في لوحة تحكم البرنامج. إجمالي زمن الاقتناء لصورة واحدة هو ~1.2 ثانية. اضبط حجم الخطوة على 150 نانومتر، بحيث يكون حجم الصورة حوالي 30 × 30 ميكرومتر^مربع. صور على الأقل ثلاثة مجالات رؤية لكل عينة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
التضمين الصوتي البصري	غوتش وهاوسغو	R15180-1.06-LTD	تعديل الليزر يشعل شعاع الليزر
أموكسيسيلين	سيغما ألدريتش	A8523-5G
مرشح تمرير النطاق الكهربائي	الكروما	HQ825/150م	حجب شعاع ليزر ستوكس قبل الفوتوديود
كلوريد الكالسيوم	سيغما ألدريتش	C1016-100G	تعديل الكاتيون
مرق مولر-هينتون المعدل بالتيون	فيشر ساينتيفك	B12322	اختبار حساسية المضادات الميكروبية للكائنات الدقيقة باستخدام طرق تخفيف المرق
الطرد المركزي	ثيرمو ساينتفيك	75002542
نظارات التغطية	VWR	16004-318
أنبوب الزراعة مع غطاء القطع	علامة فيشر	149569B
أكسيد الديوتيريوم		151882	مذيب عضوي لإذابة المضادات الحيوية
أكسيد الديوتيريوم-d6	سيغما ألدريتش	156914	المذيب العضوي كمعيار لمعايرة نظام تصوير SRS
الإشريكية القولونية BW 25113	مركز المخزون الجيني للقولون	7636
أنابيب الطرد المركزي الدقيق من البولي بروبيلين من إبندورف بحجم 1.5 مل	علامة فيشر	05-408-129
جنتاميسين كبريتات	سيغما ألدريتش	G4918
مرشحات فلوريد بولي فينيليدين المحبة للماء	ميليبور-سيغما	SLSV025NB	حجم المسام: 5 ميكرومتر
ليزر نبضي فيمتوثانية إنسايت ديب سي	فيزياء الطيف	النموذج: insight X3	مصدر ليزر قابل للضبط ومصدر ليزر ثابت عند 1045 نانومتر لتصوير SRS
مضخم القفل	زيورخ إنسترومنت	HF2LI	إزالة التعديل لإشارات SRS
مكثف الزيت	أوليمبوس	U-AAC	NA 1.4
سودوموناس إيروجينوزا ATCC 47085 (PAO1)	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 47085
الفوتوديود	هاماماتسو	S3994-01	الكاشف
أنبوب مخروطي بولي بروبيلين 15 مل	فالكون	14-959-53A
مرشحات البولي بروبيلين	ثيرمو ساينتفيك	726-2520	حجم المسام: 0.2 ميكرومتر
أطباق البتري المعقمة	كورنينغ	07-202-031
الحقنة 10 مل	علامة فيشر	14955459
مطياف الفوتومتر فوق بنفسجي/الرؤية	بيكمان كولتر	الطراز: DU 530	قياس الكثافة الضوئية عند طول موجي 600 نانومتر
خلاط الدوامة	VWR	97043-562
هدف الماء	أوليمبوس	UPLANAPO/IR	60×، NA 1.2