نموذج الأمعاء في المختبر لتقييم التصاق البكتيريا واستبطانها

الملخص

المصدر: كالاتايود أرويو، م.، وآخرون. تقييم جدوى اتحاد بكتيريا صناعي على واجهة المضيف والميكروب في المختبر. J. Vis. Exp. (2018).

يعرض هذا الفيديو نموذجا لمضيف وميكروب في الأمعاء في المختبرات لدراسة فعالية البكتيريا. يتم حضن زراعة مشتركة لخلايا Caco-2 وHT29-MTX مع بكتيريا معالجة مسبقا في ظروف هضمية محاكاة. يتم تقييم سلامة حاجز الظهارة باستخدام مقاومة كهربائية عبر الظهارة، وتجمع كسور من الوسط، والمخاط المذاب، وتحليل الخلايا المحللة، والحطام الخلوي.

البروتوكول

1. السلالات وظروف الزراعة

ملاحظة: تكونت مجتمع الفم الصناعي من سلالات شائعة في الميكروبيوم الفمومي.

1. احصل على السلالات التالية من مجموعة الزراعة النوعية الأمريكية (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718)، Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953)، Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277)، Prevotella intermedia (ATCC 25611)، Streptococcus mutans (ATCC 25175)، Streptococcus sobrinus (ATCC 33478)، Actinomyces naeslundii (ATCC 51655)، المكورات العقدية الغوردونية (ATCC 49818)، أكتينومايسيس فيسكوزوس (ATCC 15987)، والتهاب المكورات العقدية (ATCC 49456).
2. اقتناء Veillonella parvula من معهد لايبنيتس DSMZ-مجموعة الكائنات الدقيقة وزراعة الخلايا الألمانية (DSM 2007)، ومكورات العقدية السنغوينيس من مجموعة بكتيريا BCCM/LMG (LMG 14657)، واستخدام سلالة Streptococcus slabvarius TOVE-R، وStreptococcus oralis.

2. تطوير مجتمع متعدد الأنواع يمثل ميكروبيوم الفم

ملاحظة: إنشاء مجتمع صناعي لمحاكاة القدرة المحتملة للالتصاق البكتيريا الفموية على الظهارة في المختبر . نزرع البكتيريا على صفائح الأجار الدموية المدعومة ب 5 ميكروغرام/مل هيمين، و1 ميكروغرام/مل ميناديون، و5٪ دم حصان معقم مزيل للصدمة. باختصار:

1. قم بإذابة 100 ملغ من الهيمين في 2 مل من هيدروكسيد الصوديوم بوزن 1 ملم (NaOH)، وأضف 100 مل من الماء المقطر المعقم بالأوتكلاف. خزن في حاوية داكنة. قم بتعقيم الفلتر بحجم 0.22 ميكرومتر قبل إضافته إلى الوسط.
2. قم بإذابة 100 ملغ من ميناديون في 20 مل من الإيثانول بنسبة 96٪. قم بتعقيم الفلتر بحجم 0.22 ميكرومتر قبل إضافته إلى الوسط.
3. حضر 1 لتر من وسط آجار الدم (انظر جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وجهاز المعقم (الأوتوكلاف). دعها تبرد قبل إضافة دم الحصان والمكملات. اخلط واصب الصحون.
4. حضر مرق حقن القلب المعدل (BHI). أضف 5 ميكروغرام/مل من الهيمين و1 ميكروغرام/مل من الميناديون بعد التعقيم الداخلي.
5. قم بتوزيع 9 مل من الوسط في أنابيب Hungate، وأغلق بقفل مطاطي وغطاء من الألمنيوم. اشطف الأنابيب بالنيتروجين/ثاني أكسيد الكربون أو_N2/CO₂ (90٪/10٪).
6. استرجع 1 مل من وسط لاهوائي باستخدام حقنة وضعه في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل. اختر مستعمرات فردية لكل نوع بكتيريا، ثم يعيدها في الوسط، ثم يعيدها إلى BHI المعدل اللاهوائي. احتضن لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، باستثناء S. slivarius الذي يجب حضنه لمدة 24 ساعة.
7. إذا لزم الأمر، تأكد من نقاء الثقافات قبل تجميع المجتمع الصناعي. باختصار:
   1. استخلاص الحمض النووي من المزارع السائلة وتضخيم جين 16S rRNA باستخدام البادئات 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) و1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT)، والبرنامج التالي: 5 دقائق عند 95 درجة مئوية، 30 دورة من 95 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، 55 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، و72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة، تليها خطوة تمديد نهائية مدتها 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
   2. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام مجموعة تجارية (انظر جدول المواد)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. إجراء تفاعل التسلسل للمنتجات المنقاء في حجم إجمالي 10 ميكرولتر يحتوي على 0.5 ميكرولتر من الصبغة (انظر جدول المواد)، و3.2 ميكرومول من برايمر M13f (CGCCAGGGTTTCCCAGTCACGAC)، و2.0 ميكرولتر من مخزن تسلسل 5x، و20 نانوغرام من القالب، باستخدام نظام تسلسل تجاري مع مجموعة (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: أجرينا هذا الإجراء تجاريا.
   4. قم بإجراء بحث BLAST على جميع التسلسلات (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) لتحديد أقرب تصنيف معروف ومقارنته مع تسلسل السلالة الأصلية باستخدام أداة RDP Classifier عبر الإنترنت (http://rdp.cme.msu.edu/) وخدمة محاذاة SINA (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. قس عدد الخلايا في نهاية الحضانة، باستخدام قياس تدفق الخلايا وصبغة يوديد SYBR Green/Propidium Iodide. قم بتخفيف الزراعة إلى 10^{أو 5} خلايا ^mL-1، باستخدام BHI معدل.
9. أضف 1 مل من S. mitis إلى 75 مل من BHI اللاهوائي وحضانة حتى المرحلة الثابتة (6 ساعات). بعد ذلك، اجمع 0.75 مل من كل سلالة مخففة وامزج تحت ظروف لاهوائية.
10. بعد خلط جميع المزارع، خذ 1 مل من الميكروكوزم، وأضف إلى 75 مل من BHI. احتضن المجتمع الصناعي تحت 10٪ ثاني أكسيد الكربون₂، 10٪ هيدروجين (_H2)، 80٪ نيترجن، لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية و200 دورة في الدقيقة (انظر جدول المواد).
11. قس كثافة الخلايا كما في 2.8. قبل تقديم نموذج الخلية للمجتمع. يمكن تقييم تركيبة المجتمع باستخدام PCR الكمي في الوقت الحقيقي. بالإضافة إلى ذلك، استخدم تسلسل مضخمات جين 16S rRNA لتوفير معلومات عن الأعضاء الأوائل الموجودين. لأي من البروتوكوليين لتأكيد الهوية، استخدم cDNA كقالب للدلالة على البكتيريا التي تنسخ البروتينات بنشاط، واستخدم الحمض النووي كقالب للكشف عن وجود أو غياب السلالات.

3. الممارسات العامة لزراعة الخلايا

ملاحظة: احصل على خطوط الخلايا المستخدمة من المجموعة الأوروبية لزراعة الخلايا المعتمدة (Caco-2 ECACC 86010202 وHT29-MTX-E12 ECACC 12040401، الصحة العامة في إنجلترا، المملكة المتحدة). يمكن شراء كواشف زراعة الخلايا (انظر جدول المواد)، ما لم يذكر خلاف ذلك.

1. صيانة ومرور خطوط خلايا Caco-2 وHT29-MTX ملاحظة: تزرع خلايا Caco-2 وHT29-MTX بشكل روتيني في قوارير زراعة الأنسجة بحجم 25 سم^مربع تحتوي على وسط النسر المعدل (DMEM) من دولبيكو (DMEM) (الجدول 1). يتم تريبسين الخلايا عند الوصول إلى 60–70٪ من التقاء البعض.
   1. أزل وسط زراعة الخلايا من القوارير. اغسلي مرتين ب 5 مل من PBS بدون الكالسيوم/المغنيسيوم (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. أضف 2 مل من محلول 0.5 ملغ/لتر من التربسين و0.22 جرام/لتر إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA). وزع محلول التربسين عن طريق تحريك القارورة بلطف. أزل 1.5 مل من محلول التربسين وحضن القارورة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   3. تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا منفصلة عن سطح القارورة. حضن لمدة 5 دقائق إضافية إذا لزم الأمر.
   4. أضف 5 مل من وسائط زراعة الخلايا المكملة إلى القارورة لتعطيل التربسين. ترفع وتخفض لتحصل على تعليق خلية واحدة متجانس.
   5. فورا، خذ 50 ميكرولتر من نظام تعليق الخلية وامزجه مع محلول تريبان الأزرق المعقم بنسبة 1:1 (v/v) لخلايا Caco-2 أو 1:5 v/v لHT29-MTX. اخلط عن طريق التوصيل بالماصات وتحميله في غرفة عد (انظر جدول المواد).
   6. عد الخلايا الحية (الخلايا البيضاء اللامعة) تحت المجهر (انظر تعليمات الشركة المصنعة).
   7. البذور في قارورة جديدة بكثافة 4 × 10⁵ خلايا/سم² و1 × 10⁴ خلايا/سم²، لكاكو-2 وHT29-MTX على التوالي.
      ملاحظة: (1) تتمايز خلايا Caco-2 وتشكل وصلات محكمة بمجرد وصولها إلى نقطة التقاء واحدة. من المهم جدا تجنب التقاء مفرط قبل التريبسين. يمكن أن يؤدي النمو الزائد للخلايا في القارورة إلى فشل انفصال الخلايا بعد التريبسين و/أو تجمع الخلايا. (2) خلايا HT29-MTX هي خلايا منتجة للمخاط ذات نشاط أيضي عالي. قد تسبب هذه الخصائص تحمض سريع في وسط زراعة الخلايا، خاصة إذا كانت الخلايا ذات كثافة عالية. يمكن إضافة 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) إلى وسط زراعة الخلايا (الجدول 1) للحفاظ على الرقم الهيدروجيني بين 7 و7.2. إذا انخفض الرقم الهيدروجيني، يمكن تبادل الوسط عندما يكون التقاء أقل من 50٪. ومع ذلك، إذا كان التقاء >50٪، يجب تقسيم مزرعة الخلية.

4. تجميع نموذج خلية متعددة الأقسام يحاكي واجهة المضيف والميكروبات في الأمعاء

ملاحظة: أكمل الزراعة المشتركة في آبار ذات حجرة مزدوجة (قطر 24 مم، حجم المسام 0.4 ميكرومتر؛ انظر جدول المواد).

1. أضف 1.5 مل من وسط زراعة الخلايا الكامل إلى الحجرة القمية و2 مل إلى القاعدة. احتضن قبل الحضانة لمدة 20–30 دقيقة للحصول على توزيع متساو لتعليق الخلية أثناء البذر.
2. تريبسين زراعة الخلايا في Caco-2 وHT29-MTX كما هو موضح في القسم 3. يجب اتباع إجراء التربسين بدقة لتحقيق توزيع متجانس لكلا خطي الخلايا، في تعليق خلوي واحد، دون تجمعات.
3. عد الخلايا الحية كما هو موضح في 3.1.8.
4. قم بضبط كثافة الخلايا إلى 6.5 × 10⁴ خلايا/سم² بنسبة 90/10 من خلايا Caco-2/HT29-MTX.
5. قم بتجانس معلقات الخلايا وإضافة الحجم المقابل لخلايا Caco-2 وHT29-MTX إلى حاوية معقمة مملوءة مسبقا مع وسائط زراعة الخلايا المكملة. قم بإزالة الوسط الموجود مسبقا من الجانب الأميالي للغرفة عن طريق الشفط.
6. اخلط تعليق الخلية بلطف عن طريق التوصيل بالماصات، وانقل 1.5 مل إلى الحجرة القمية في إدخالات الحجرة. تتطلب عملية البذر تجانسا مستمرا لتعليق الخلية، حيث تميل الخلايا إلى الترسيب الداخلي. اعتمادا على تجربة المستخدم وسرعة العمل، يجب خلط نظام تعليق الخلية بعد صرف 1–3 آبار.
7. حرك الصفائح بلطف للخلف والأمام ثم من اليمين إلى اليسار إلى اليمين (5–10 مرات) للحصول على توزيع متساو للخلايا في البئر. انقله إلى الحاضنة وكرر حركة الصفائح.
8. حافظ على الاستنتاج المشترك لخلايا Caco-2/HT29-MTX لمدة 15 يوما، مع تجديد الحجرات القمية والقاعدية كل يومين مع مكمل DMEM. بعد هذه الفترة، يمكن استبدال وسط زراعة الخلايا إلى مكمل DMEM بدون محلول مضاد حيوي أو مضاد للفطريات.
9. حافظ على النظام حتى 20–21 يوما بعد الزراعة عن طريق تجديد الوسط كل يومين.
10. قم بقياس سلامة الحاجز الظهاري قبل بدء الاختبار، باستخدام نظام المقاومة الكهربائية (انظر جدول المواد)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. تأكد من أن معدات المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) مشحونة بالكامل (>24 ساعة) قبل بدء القياسات.
    2. افصل معدات TEER عن مصدر الطاقة وغطيها بكيس أوتوكلاف بلاستيكي. اصنع ثقبا في الكيس لإدخال القطب الكهربائي وتوصيله في منفذ الإدخال في العداد. رش بنسبة 70٪ إيثانول/ماء (v/v) قبل إدخال معدات TEER إلى خزانة التدفق.
    3. لتعقيم القطب، اغمر أطراف القطب في محلول 70٪ إيثانول/ماء لمدة 15 دقيقة. اتركه ليجف في الهواء لمدة 15 ثانية. شطف القطب في وسط زراعة الخلايا المدفأ مسبقا.
    4. أخرج الخلايا من الحاضنة ودع الخلايا تصل إلى درجة حرارة الغرفة داخل خزانة التدفق.
    5. تأكد من أن العداد مفصول عن الشاحن. اضبط مفتاح الوضع على أوم وشغل مفتاح الطاقة.
    6. قس مقاومة الخلية عن طريق غمر القطب مع الطرف الأقصر في الإدخال والطرف الأطول خارج البئر. حافظ على زاوية القطب 90° مع إدخال اللوحة.

5. البقاء على قيد الحياة البكتيرية بعد ظروف العبور المجهوي في المختبر

ملاحظة: حضر جميع التخفيفات بماء فائق النقي. تعقيم جميع المحاليل بالفلتر عبر مرشح بحجم 0.22 ميكرومتر ونفذ عملية الهضم في ظروف معقمة.

1. الهضم الفموي:
   1. ضع 3 مل من مجتمع البكتيريا في أنبوب معقم بسعة 50 مل، وامزجه مع 3 مل من سائل اللعاب المحاكى (SSF)، الذي يحتوي على (في ملمول ^L-1): كلوريد البوتاسيوم (KCl)، 15.1؛ فوسفات ديهيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄)، 3.7؛ بيكربونات الصوديوم (NaHCO₃)، 6.8؛ سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم [MgCl₂(H₂O)₆]، 0.5، كربونات الأمونيوم [(NH₄) CO₃]، 0.06؛ حمض الهيدروكلوريك (HCl)، 1.1؛ ديهيدرات كلوريد الكالسيوم [CaCl₂(H₂O)₂]، 0.75. أضف 75 وحدة لكل مل من α-الأميلاز من لعاب الإنسان من النوع IX-A و2 جم/لتر من الموكين من معدة الخنزير النوع الثاني إلى الحمض الصلب.
   2. حضن الخليط لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية و100 دورة في الدقيقة. اجمع عينة بحجم 2 مل لاستخراج الحمض النووي وقياس التدفق الخلوي (S1).
2. الهضم المعدي:
   1. أضف 4 مل من السائل المعدة المحاكى (SGF)، الذي يحتوي على (بوحدة mmol L-1): KCl، 6.9؛ KH₂PO₄، 0.9; NaHCO₃، 25؛ كلوريد الصوديوم (NaCl)، 47.2؛ MgCl₂(H₂O)₆، 0.1; (NH₄)CO₃، 0.5; HCi، 15.6؛ CaCl₂(H₂O)₂، 0.075. بالإضافة إلى ذلك، احتوى SGF على 2 جرام/لتر من الميوسين من معدة الخنزير من النوع الثاني.
   2. قس الرقم الهيدروجيني وضبط الرقم الهيدروجيني 3 مع 1 ميجاليزر HCl إذا لزم الأمر. حضن عند 37 درجة مئوية و100 دورة في الدقيقة. اجمع عينة بحجم 2 مل (S2).
3. الهضم في الأمعاء الدقيقة:
   1. أضف 4 مل من سائل الأمعاء المحاكى (SIF) الذي يحتوي على (بوحدة mmol L-1): KCl، 6.8؛ KH₂PO₄، 0.8; NaHCO₃، 85؛ NaCl، 38.4؛ MgCl₂(H₂O)₆، 0.33; HCi، 8.4؛ CaCl₂(H₂O)₂، 0.3، إلى أنبوب الهضم.
   2. قم بضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7 مع 1 ميلار NaOH إذا لزم الأمر. حضن عند 37 درجة مئوية و100 دورة في الدقيقة. اجمع عينة بحجم 2 مل (S3).

6. القدرة على استعمار البكتيريا بعد ظروف الانتقال المجهي.

1. الطرد المركزي بمقدار 2 مل من الهضم بالأمعاء الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 2,650 × جرام.
2. أزل المادة الفائقة وامزج الحبيبات البكتيرية مع 5 مل من DMEM المكملة بدون مضادات حيوية ومضادات فطرية.
3. قم بصبغ وقياس الخلايا السليمة أو التالفة باستخدام جهاز قياس تدفق الخلايا (انظر جدول المواد).
4. قم بضبط كثافة الخلايا إلى 10^{إلى 5} خلايا صالحة لكل مل عن طريق تخفيف الكمية في DMEM المكملة بدون مضادات حيوية ومضادات الفطريات.
5. قم بإزالة الوسط القمي لنظام الترانسويل وإضافة 1.5 مل من التعليق البكتيري. الزراعة المشتركة للنظام لمدة ساعتين تحت ظروف زراعة الخلايا العامة (37 درجة مئوية، 95٪ رطوبة، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).
   ملاحظة: يمكن تمديد هذه الفترة حتى 48 ساعة، حسب البروتوكول التجريبي المطلوب. يمكن الحفاظ على الزراعة المشتركة في حاضنة مختلفة عن تلك المستخدمة في صيانة الخلايا الروتينية، لتجنب التلوث.
6. قياس قيم TEER بعد الحضانة لتقييم سلامة الحاجز الظهاري كما هو موضح في 4.11.
7. عند إكمال فترة الحضانة، قم بإزالة الوسط القمي، وجمع 0.5 مل لمزيد من التحليلات (S4). يمكن استخدام عينة فرعية من الوسط لتقييم بقاء الخلايا بواسطة اختبار لاكتات ديهيدروجيناز (LDH) (انظر جدول المواد)، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
8. أضف 0.5 مل من 10 ملليموتر N-أستيل سيستيتين في HBSS (مخزن NAC) لإذابة المخاط الناتج عن HT29-MTX واستعادة البكتيريا الملتصقة. حضن الصفائح على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، تحت التحريك (135 دورة في الدقيقة، انظر جدول المواد).
9. استرجع NAC-HBSS في أنبوب طرد مركزي دقيق (S5) وغسل الخلايا مرتين ب 1 مل DPBS.
10. أضف 0.5 مل من ترايتون X-100 بنسبة 0.5٪ (مع الطبقات الأحادية)، وقم بتعطيل الخلايا عن طريق التوصيل بالمشاة، واسترد السائل، واسترجع الدوامة لمدة دقيقة واحدة. السرعة ضرورية لتجنب إتلاف الخلايا البكتيرية باستخدام المنظف.
11. قم بعمل طرد مركزي على الخلايا لمدة 5 دقائق عند 2,650 × جرام، وافصل المادة الفائقة (S6) عن الحبيبة (S7).

7. تحليل العينة

ملاحظة: تحليل العينات المجمعة (S1-S7) لتقييم قدرة البكتيريا على البقاء وإمكانية الالتصاقها بخلايا الأمعاء، بعد هضم محاكى في الجهاز الهضمي.

1. قابلية البكتيريا: تمرير عينات S1-S5 مرتين عبر مرشح بحجم 0.45 ميكرومتر وقياس الخلايا البكتيرية باستخدام تلوين الخلايا الحية/الميتة وقياس تدفق الخلية، كما هو موضح في الخطوة 2.8.
2. جهد الالتصاق: جهز تخفيفات متسلسلة (-1 إلى -8) ل S1-S6 وخط 10 ميكرولتر في أجار الدم وألواح BHI المعدلة. الحضانة عند 37 درجة مئوية تحت ظروف لا هوائية لمدة 24–48 ساعة. ضع نفس حجم S7 غير المخفف.
   1. التعرف التصنيفي على البكتيريا الملتصقة:
      1. اختر مستعمرات فردية ذات حلقة زراعة وأعد تعليق كل واحدة في 10 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. اجمع 4 ميكرولتر من هذا التعليق واستخدمه كقالب لتضخيم PCR لجين 16S rRNA باستخدام البادئات والظروف الموصوفة في 2.7.1.
      2. قم بإجراء التسلسل وفقا للبروتوكول في 2.7.3، والتحقق من صحة التسلسل باستخدام الإجراء المدرج في 2.7.4.
3. قم بإجراء تحليلات لاحقة مثل استخراج الحمض النووي الكلي، وقياس qPCR، و/أو تسلسل مكبرات 16S rRNA، واستخراج الحمض الريبي، والتنميط النسخي حسب الرغبة.
   ملاحظة: تم إجراء قياس كمية التدفق الخلوي مباشرة بعد أخذ العينة. كأداة تحكم للخلايا المنفاذة للغشاء، تم استخدام عينة تعرضت لدرجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. تم تقييم الضوضاء الخلفية من خلال قياس سوائل الهضم أو العينات المأخوذة من نموذج زراعة الخلايا باستخدام القياس الخلوي التدفقي دون البكتيريا. تم قياس كل عينة بثلاث نسخ.

 

الجدول 1: وصف خطوط الخلايا وتركيب الوسائط لصيانة زراعة الخلايا.

زراعة الخلايا	ملتزم/تعليق	وسيط الزراعة	ملحقات عامة	ملحقات محددة	مضاعفة الوقت	ظروف الحضانة
كاكو-2 (ECACC 86010202)	أتباع	وسط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بتركيز 4.5 جرام/لتر من الجلوكوز	مصل البقر الجنيني المعطل (10٪ v/v) البنسلين (100 U/mL)* ستربتوميسين (0.1 mg/mL)* أمفوتريسين (0.0025 mg/mL)*	جلوتامكس (4 ملم) الأحماض الأمينية غير الأساسية (1٪ v/v) بيروفات (1 ملم)	65–72 ساعة	95٪ رطوبة و10٪ حاضنةثاني أكسيد الكربون2 (انظر جدول المواد)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	أتباع			HEPES (1 mM)	20–24 ساعة
* تم إزالة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات من وسط زراعة الخلايا قبل يومين من بدء الفحوصات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
السلالات
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 43718
نواة فوسوباكتيريوم	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 10953
بورفيروموناس جينجيفاليس	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 33277
بريفوتيلا إنترميديا	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 25611
المكورات العقدية المتحولة	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 25175
المكورات العقدية الصاخبة	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 33478
أكتينومايسيس فيسكوزوس	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 15987
المكورات العقدية اللعابية TOVE-R
التهاب المكورات العقدية	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 49456
المكورات العقدية الساغوينيس	مجموعة بكتيريا BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	معهد لايبنيتس DSMZ - مجموعة الكائنات الدقيقة وزراعة الخلايا الألمانية	DSM 2007
المكورات العقدية العقدية	مجموعة ثقافة الأنواع الأمريكية	ATCC 49818
خطوط الخلايا
خلايا كاكو-2	المجموعة الأوروبية لزراعة الخلايا المعتمدة	86010202
خلايا HT29-MTX	المجموعة الأوروبية لزراعة الخلايا المعتمدة	12040401
المواد الكيميائية والمستهلكات
مرق حقن القلب الدماغي (BHI)	أكسويد	CM1135
بلود آجار 2	أكسويد	CM0055	وسط بلود آجار
ميناديوني	سيغما	M9429
همين	سيغما	H9039
5٪ دم حصان معقم مزيل الدماغ	مختبرات E&O المحدودة،	P030
مجموعة InnuPREP PCRpure	أناليتيك ينا	845-KS-5010250	مجموعة تنقية PCR
بيغ داي	أنظمة حيوية تطبيقية	4337454	صبغة للتسلسل
مجموعة تسلسل الدورة ABI Prism BigDye Terminator v3.1	أنظمة حيوية تطبيقية	4337456
SYBR Green I	إنفيتروجين	S7585
يوديد البربيديوم	إنفيتروجين	P1304MP
قوارير زراعة T25 غير مغطى، معالجة بزراعة الخلايا أو تهوية أو معقمة	VWR	734-2311
حل تريبسين-إيدتا	سيغما-ألدرتش	T3924-100ML
محلول تريبان بلو 0.4٪، سائل، مصفى بالتصفية	سيغما-ألدرتش	T8154
محلول الفوسفات المخزن (PBS)	جيبكو	14190250
وسائط زراعة خلايا DMEM، مع GlutaMAX وPyruvate	تقنيات الحياة	31966-047
إدخالات زراعة خلايا الغشاء البوليستر من كورنينغ ترانسويل	سيغما-ألدرتش	CLS3450-24EA
المخاطين من معدة الخنزير من النوع الثاني	سيغما-ألدرتش	M2378
مصل البقر الجنيني المعطل	جرينر بيو ون	758093
مضاد حيوي-مضاد للفطريات (100X)	جيبكو	15240062
ترايتون X 100 لعلم الأحياء الجزيئي	سيغما-ألدرتش	T8787
DPBS بدون كالسيوم، المغنيسيوم	جيبكو	14190-250
مجموعة اختبار السمية الخلوية من بيرس LDH	ثيرمو فيشر العلمي	88953
بئر Corning HTS Transwell-24، حجم المسام 0.4 ميكرومتر	شركة كورنينج كوستار	3450
مياه خالية من النوكلياز	الرحلان الكهربائي السيرفي	28539010
المعدات
غرفة عد نويباور محسنة	كارل روث	T729.1
مقياس تدفق BD Accuri C6	بكالوريوس العلوم الحيوية	653118
باورلايزر 24 هوموجينايزر	موبيو	13155
T100 Thermal Cycler	بيوراد	186-1096
نظام التدفق	صنع حسب الطلب	-
جهاز هزاز الحاضنة InnOva 4080	نيو برونزويك العلمي	8261-30-1007	شاكر ل 2.10
حاضنة CO₂ ميميرت	شركة ميميرت GmbH & Co.	ICO150med
نظام المقاومة الكهربائية (Millicell ERS)	EMD ميليبور، ميرك KGaA	MERS00002
ميليبور ميلي-كيو الأكاديمي، نظام مياه فائقة النقاء	ميليبور، ميرك KGaA	-
شاكر (أساسي ROCKER 3D)	إيكا	4000000	شاكر ل 6.10