$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. عزل الحمض النووي الجينومي من أنسجة النبات باستخدام مجموعة استخراج جينومية
- احصل على نسيج أوراق الحمضيات عن طريق قطع ورقة جديدة كاملة من شجرة حمضيات باستخدام مقص نظيف، وضع الورقة في كيس ساندويتش بلاستيكي نظيف.
ملاحظة: يجب وضع الكيس الذي يحتوي على نسيج الورقة في ثلاجة بدرجة حرارة 4 درجات مئوية أو على الثلج في وعاء معزول في أقرب وقت ممكن بعد الجمع لتجنب التلف. - أضف كمية صغيرة من النيتروجين السائل لتبريد الهاون والمدقة. أثناء التبريد، استخدم المقص لقص قطعة صغيرة من نسيج الورقة، بحجم يقارب 1 بوصة مربعة. ضع النسيج المقطوع في الهاون لتجميده فورا. أضف المزيد من النيتروجين السائل إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يجب دائما ارتداء قفازات معزولة أثناء التعامل مع النيتروجين السائل. - قم بطحن نسيج النبات بسرعة إلى مسحوق ناعم باستخدام الملاط. استمر في الطحن حتى يتبخر النيتروجين السائل تماما، ويبقى مسحوق أخضر ناعم.
- قم بتبريد ملعقة معدنية في نيتروجين سائل لفترة وجيزة لمدة 10 - 15 ثانية، ثم قم بجمع الأنسجة الأرضية داخل الهاون إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل باستخدام الملعقة.
- أضف 600 ميكرولتر من محلول تحلل النوى (انظر جدول المواد) باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر. اعمل العينة على الفورتكس لمدة 1 - 3 ثوان، ثم حضن في حمام ماء بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- أضف 3 ميكرولتر من محلول RNase إلى الليزات باستخدام ماصة بسعة 10 ميكرولتر، ثم قلب الأنبوب 2 - 5 مرات لخلطه، وحضنه عند 37 درجة مئوية في حاضنة الخزانة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: اترك الخليط ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة. - أضف 200 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين، والدوامة بسرعة عالية لمدة 20 ثانية، ثم الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 13,000 × جرام لتكوين حبيبة صلبة. أثناء الطرد المركزي للعينة، أضف 600 ميكرولتر من إيزوبروبانول في درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل.
- باستخدام ماصة بسعة 1000 ميكرولتر، يتم إزالة المادة الفائقة بعناية من العينة الطردية المركزية، ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد بسعة 1.5 مل يحتوي على إيزوبروبانول. يمكن الآن التخلص من الحبيبة.
ملاحظة: تجنب تلويث المادة الفائقة بالبروتين بترك كمية ضئيلة جدا من المادة فوق الحبيبة. - اقلب الأنبوب حتى يصبح الحمض النووي مرئيا ككتلة من خيوط تشبه الخيط، ثم قم بالطرد المركزي بحرارة 13,000 × g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإخراج السوبرناتان، وإضافة 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70٪ إلى الحبيبة، وقلب الأنبوب عدة مرات لغسل الحمض النووي، وقم بغسل الطرد المركزي بقوة 13,000 x g لمدة دقيقة واحدة.
- استنشق الإيثانول بحذر، تاركا الحبيبة الفضفاضة للحمض النووي، ثم افتح وقلب الأنبوب، مستندا إلى ورق ماص. تجف في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- أضف 100 ميكرولتر من محلول إعادة ترطيب الحمض النووي إلى الحبيبة المجافة، ثم حضن الحمض النووي في حمام ماء بدرجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، مع الخلط بشكل دوري عن طريق النقر على الأنبوب.
- ضع 1 ميكرولتر من الماء النقي في ميكروكوفيت، وأدخله في مقياس طياف ليستخدم كمخزن فراغ. احسب تركيز الحمض النووي الموجود عن طريق وضع 1 ميكرولتر من العينة في الميكروكوفيت وإدخالها في مقياس الطيف الضوئي. يمكن حساب تركيز الحمض النووي (ng/μL) بأنه (A260 - A320) × عامل تخفيف × 50 ng/μL.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية.