تعبئة الفيروسات الكاذبة عن طريق تعداء فوسفات الكالسيوم قم بإعداد معلقات أحادية الخلايا من خلايا HEK293FT (بتركيز 9 × 10^5 خلية لكل مل) في وسط DMEM (وسط إيجل المعدل من قبل دولبيكو) الكامل (الجدول 1). أضف 10 مل من المعلق أحادي الخلايا إلى دورق T75، واحضن الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وبتركيز 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO2) لمدة 20 ساعة قبل عملية التعداء. ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا HEK293FT ذات ممر منخفض (أقل من 20 ممراً). تأكد من أن الطبقة الخلوية الأحادية قد وصلت إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80-90%. استبدل الوسط بـ 10 مل من وسط كامل طازج يحتوي على الكلوروكين (100 ميكرومولار) قبل ساعتين من التعداء. امزج الكواشف والحمض النووي البلازميدي كما هو موضح في الجدول 2 والشكل 1: ddH2O (ماء مقطر مرتين)، وpCMV/R-HA، وpCMV/R-NA، وpHR-Luc، وpCMV Δ8.9، وCaCl2 (كلوريد الكالسيوم) بتركيز 2.5 مولار، ومحلول HEPES (حمض 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبيرازين إيثان سلفونيك) المنظم بتركيز 2x. اسحب المزيج وأطلقه باستخدام الماصة 5 مرات بلطف؛ ثم احضن المزيج في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة. انقل المزيج إلى الوسط الموجود فوق الخلايا، وهز الدورق بلطف. احضن الخلايا في حاضنة الخلايا لمدة 15 ساعة. استبدل الوسط بـ 15 مل من وسط DMEM الكامل الطازج. احضن الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة 65 ساعة. ملاحظة: سيكون لون الوسط برتقالياً فاتحاً أو مائلاً للاصفرار قليلاً، ويجب أن تظهر التأثيرات المرضية الخلوية (CPE) في 80% على الأقل من الخلايا تحت المجهر الضوئي المقلوب. اجمع السائل الطافي، وقم بطرده مركزياً عند 2095 × g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. اجمع السائل الطافي، وقم بتقسيمه إلى حصص، وخزنه عند درجة حرارة -80 درجة مئوية. الجدول 1: تركيب وسط DMEM الكامل. تركيب وسط DMEM الكامل | التركيز --- | --- وسط إيجل المعدل من قبل دولبيكو (DMEM) | 1x مصل جنين البقر | 10% بنسلين (1 وحدة/مل)/ستربتوميسين | 1 ميكروجرام/مل الجدول 2: نظام تعبئة الفيروسات الكاذبة. المواد | التركيز | الحجم --- | --- | --- HEPES بتركيز 2x (الرقم الهيدروجيني 7.1) | -- | 675.0 ميكرولتر CaCl2 (2.5 مولار) | -- | 67.5 ميكرولتر ddH2O | -- | 529.2 ميكرولتر pCMV Δ 8.9 | 1000 نانو جرام/ميكرولتر | 18.9 ميكرولتر pCMV/R-HA | 100 نانو جرام/ميكرولتر | 27.0 ميكرولتر pCMV/R-NA | 50 نانو جرام/ميكرولتر | 13.5 ميكرولتر pHR-Luc | 1000 نانو جرام/ميكرولتر | 18.9 ميكرولتر تشانغ، إكس.، وآخرونتحضير فيروسات إنفلونزا الطيور H5 ذات النمط الكاذب باستخدام طريقة ترانزفكشن فوسفات الكالسيوم وقياس نشاط تحييد الأجسام المضادة. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2021)
يوضح هذا الفيديو كيفية إنتاج الفيروسات الكاذبة للإنفلونزا في خلايا بشرية باستخدام ترنسفكشن البلازميد بوساطة فوسفات الكالسيوم، مما يسمح بالتوليد الآمن لجسيمات فيروسية أحادية الدورة للتطبيقات اللاحقة، مثل مقايسات تحييد الأجسام المضادة تحت ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية.
