إسكات الميكرو آر إن إيه (miRNA) القائم على فيروس البطاطس X في نباتات البطاطس

الملخص

المصدر: جاو، ج.، وآخرون. إسكات الـ microRNA القائم على فيروس البطاطس X (VbMS) في البطاطس. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp.) (2020).

يوضح هذا الفيديو استخدام Agrobacterium tumefaciens لإيصال بنية قائمة على فيروس البطاطس X (PVX) إلى نباتات بطاطس منمّاة في المختبر (in vitro) لغرض إسكات microRNA القائم على الفيروس (VbMS). وتتيح هذه الطريقة التثبيط الجهازِي لـ microRNA مستهدف، مما يسمح للباحثين بدراسة دوره في نمو النبات من خلال تغيرات ظاهرية يمكن ملاحظتها.

البروتوكول

1. إجراء مقايسة VbMS المعتمدة على PVX في نباتات البطاطس.

1. انقل نباتات البطاطس المستزرعة مخبرياً (in vitro) بعمر 4 أسابيع إلى التربة. ستخضع النباتات المنقولة لاختبار VbMS بعد 3-4 أيام.
2. لقّح نباتات البطاطس ببكتيريا Agrobacterium التي تحتوي على بلازميدات PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
   ملاحظة: بالنسبة لاختبار VbMS في البطاطس، يتم إجراء الترشيح بوساطة Agrobacterium والتلقيح بالخدش باستخدام عود أسنان في وقت واحد.
   1. اختر المحولات الإيجابية التي تحتوي على ناقلات PVX-STTM ولقّحها في 50 mL من وسط LB السائل الذي يحتوي على 50 μg/mL كاناميسين و 50 μg/mL ريفامبيسين. تُنمّى في حاضنة عند 28 °C وبسرعة 220 rpm لمدة 16 h حتى تصل قيمة OD₆₀₀ إلى 1.0.
   2. في الوقت نفسه، قم بتخطيط مستعمرات Agrobacterium الإيجابية على طبقين LB جديدين على الأقل يحتويان على 50 μg/mL كاناميسين و 50 μg/mL ريفامبيسين، وتُنمّى عند 28 °C لمدة يوم واحد. استخدم ناقل PVX-LIC كعينة ضابطة و PVX-GFP لمراقبة انتشار الفيروس.
   3. اجمع مستنبت Agrobacterium السائل عن طريق الطرد المركزي عند 3,400 x g لمدة 10 min في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق خلايا Agrobacterium بحجم مساوٍ من محلول الترشيح المنظم (10 mM MgCl₂، و 10 mM MES، و 200 µM أسيتوسيرينغون، pH = 5.6) واضبط القيمة لتكون OD₆₀₀ = 1.0. تُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 6 h.
   4. قم بترشيح مستنبت Agrobacterium في الجانب الظهري (abaxial) للأوراق المتمددة بالكامل باستخدام حقنة سعة 1 mL بدون إبرة.
      1. اقلب الورقة وأمسكها بإحدى يديك، ثم استخدم إصبعاً واحداً لدعم نصل الورقة من الجانب الظهري (adaxial) عند موقع الترشيح. حافظ على وضعية الحقنة بشكل عمودي على سطح الورقة باليد الأخرى وقم بترشيح مستنبت Agrobacterium في الجانب الظهري للنصل.
   5. اكشط مستنبت Agrobacterium من أطباق LB وقم بخدش سطح الساق في السلابة الأولى أو الثانية من نباتات البطاطس التي تم ترشيحها باستخدام عود أسنان. اخدش بشرة الساق برفق، وتجنب ثقب الساق لأن ذلك قد يسبب ضرراً شديداً للنباتات.
3. أنمِ النباتات المرشحة عند 22 °C مع فترة ضوئية تبلغ 16 h ضوء/8 h ظلام وبكثافة ضوء تبلغ 120 μmol/m²∙ s¹ في دفيئة زراعية.
   ملاحظة: تظهر الأنماط الظاهرية الناتجة عن إسكات miRNA عادةً في غضون 2-4 أسابيع بعد التلقيح (الشكل 1، الشكل 2). وعادة ما يستغرق ظهور النمط الظاهري لـ VbMS من 10-20 يوماً بعد الترشيح. يعتمد النمط الظاهري لـ VbMS على خصائص miRNA المحددة والجينات المستهدفة، وظروف النمو، وأصناف البطاطس.

النتائج

الشكل 1: VbMS لـ miR165/166 في صنف البطاطس رباعي المجموعة الصبغية Katahdin. الأنماط الظاهرية لنباتات البطاطس (Katahdin) التي تعبر عن ناقل PVX الضابط أو PVX-STTM165/166. تشير الأسهم الأرجوانية إلى تراكيب ورقية تشكلت في غير موضعها في عروق الأوراق....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
سلالات Agrobacterium tumefaciens: GV3101 أو GV2260 أو EHA105.
السماد: Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	شركة ICL Specialty Fertilizers، سامرفيل، كارولاينا الجنوبية 29483، الولايات المتحدة الأمريكية	G99260
MgCl2₂	ThermoFisher، والتهام، ماساتشوستس 02451، الولايات المتحدة الأمريكية	MFCD00149781
ناقل PVX VIGS: PVX-LIC
التربة: Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, الولايات المتحدة الأمريكية	Metro-Mix 360
			جاو وآخرون، 2016