تحضير المقاطع التجميدية لشبكية عين الفأر لتقييم نفاذية الشبكية للفيروس المرتبط بالغدة* (Adeno-Associated Virus)

الملخص

المصدر: Vacca, O., et al. استخدام الفيروس المرتبط بالغدة (Adeno-associated Virus) كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في المرض. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو الإجراء التفصيلي لتحضير المقاطع التجميدية لشبكية فأر لتصور نفاذية الفيروس المرتبط بالغدة (adeno-associated virus) عبر الحواجز الشبكية المتضررة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تتضمن عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات الحيوان المختصة. 

1. بالنسبة للمقاطع العرضية بالتجميد للشبكية (الشكل 1يتم تشريح العيون المستأصلة لإزالة العدسة والقرنية، ثم تُثبت بالغمر في بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة ساعة واحدة.
   1. قم بإجراء الحماية من التجميد للعيون المثبتة مسبقاً في محلول سكروز بتركيز 10% لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم في محلول سكروز بتركيز 20% لمدة ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بإجراء الحماية من التجميد في محلول سكروز بتركيز 30% طوال الليل في درجة حرارة 4 °Cقم بتجميد أغلفة العين وطمرها في راتنج طمر مثل Cryo-matrix. ثم قم بإعداد 10 µm مقاطع تجميدية وتثبيتها على شرائح مُعالجة خصيصاً لمقاطع الأنسجة المجمدة، والتي تعمل على تحسين التصاق الأنسجة أثناء التلوين.
   2. قم بنفاذية المقاطع باستخدام 0.1% من Triton X-100 في محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) عند درجة حموضة (pH) 7.4 لمدة 5 دقائق. اغسل المقاطع مرتين بمحلول PBS، ثم قم بحجب المواقع غير المستهدفة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في محلول PBS يحتوي على 1% من ألبومين المصل البقري (BSA) و0.1% من Tween 20.

النتائج

الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول العام. بعد إنتاج الفيروس المرتبط بالغدة (AAV)، تُحقن الجسيمات في الجسم الزجاجي أو في الوريد الذنبي لتخدير الفئران البالغة. يتم التقاط صور لقاع العين باستخدام كاميرا Micron III لمتابعة تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP). يتم تحليل نمط تعبير GFP في المقاطع المجمدة للشبكية والشبكيات المثبتة بشكل مسطح بفضل الكيمياء النسيجية المناعية وصور المجهر البؤري. كما يتم تقييم عبور AAV عبر الحاجز الدموي الشبكي (BRB) عن طريق تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على عينات دم مأخوذة من الفئران المحقونة داخل الجسم الزجاجي أو داخل الصفاق، وذلك للكشف عن وجود تسلسل GFP، والذي يعد مؤشراً على وجود جسيمات AAV في مجرى الدم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
راتنج التضمين Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
شرائح الالتصاق Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
المكبر ثنائي العينين SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	تقريب 0.66 x 5 x مصابيح LEDs مع حامل إضاءة علوية وسفلية / تشريح الشبكية
مقص زنبركي مستقيم - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	تشريح الشبكية