تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تتضمن عينات حيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة أخلاقيات التعامل مع الحيوان المختصة. 1. الكيمياء النسيجية المناعية بالنسبة للعينات المسطحة من الشبكية (الشكل 1)، يتم تثبيت العيون المستأصلة في 4% بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة لتسهيل عملية التشريح. في غضون 15-30 دقيقة، يتم تشريح العيون لإزالة القرنية والعدسة. تُفصل الشبكية عن الظهارة الصبغية للشبكية (RPE) والصلبة عن طريق القطع حول المنشار (ora serrata) والعصب البصري. تُغمر العينة في 4% بارافورمالدهيد لمدة 30 دقيقة أخرى لتثبيت الشبكية والبروتين الفلوري في خلايا الشبكية المنقولة (يجب ألا تتجاوز مدة التثبيت 24 ساعة). تُغسل العينة لمدة 5 دقائق في محلول PBS معقم، بدرجة حموضة (pH) 7.4. يُستبدل محلول الفوسفات المنظم (PBS) بمحلول الحجب (PBS مع 1% ألبومين مصل بقري (BSA)، و2% مصل ماعز أو حمار طبيعي، و0.5% Triton X-100)، وتُحضن العينات في محلول الحجب إما لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل. تُحضن الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب إما لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو في درجة حرارة 4 مئوية طوال الليل. تُغسل العينات 3 مرات باستخدام PBS. ملاحظة: الأجسام المضادة المستخدمة هي كما يلي: مضاد اللامينين (1/1,000) لوسم الغشاء المحدد الداخلي (ILM)، ومضاد الرودوبسين استنساخ 4D2 (1/500) لوسم الخلايا النبوتية، ومضاد سينثيتييز الغلوتامين استنساخ GS-6 (1/1,500) لوسم خلايا مولر، وليكتين agglutinin الفول السوداني (PNA) (1/40) لوسم الخلايا المخروطية. تُحضن الأنسجة مع تخفيف بنسبة 1:500 من الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بـ alexa fluor في محلول الحجب لمدة ساعة واحدة (للمقاطع المجمدة) أو ساعتين (للعينات المسطحة) في درجة حرارة الغرفة مع الحماية من الضوء. تُغسل العينات 3 مرات باستخدام PBS. تُجرى قطوع تخفيف الضغط في الشبكية وتُثبت بشكل مسطح على شريحة زجاجية بحيث يكون جانب المستقبلات الضوئية أو جانب خلايا العقد الشبكية (RGC) متجهاً للأعلى. يُضاف وسط تثبيت مائي، ثم توضع شريحة التغطية وتُحفظ العينة في درجة حرارة 4 مئوية. يتم إجراء المجهر البؤري باستخدام مجهر بؤري بماسح ليزري. يتم الحصول على الصور بالتتابع، خطاً تلو الآخر، لتقليل التداخل بين الإثارة والانبعاث. يتم تحديد حجم الخطوة وفقاً لنظرية أخذ العينات "نايكويست-شانون". تُستخدم إعدادات التعرض التي تقلل من البكسلات المشبعة بشكل زائد في الصور النهائية. تُعالج الصور ذات الـ 12 بت باستخدام برنامج FIJI، وتُسقط مقاطع Z على مستوى واحد باستخدام "الشدة القصوى" تحت وظيفة Z-project، وأخيراً يتم تحويلها إلى وضع ألوان RGB بـ 8 بت. فاكا، أو.، وآخروناستخدام الفيروس المرتبط بالغدة (Adeno-associated Virus) كأداة لدراسة الحواجز الشبكية في الأمراض. مجلة التجارب المرئية (J. Vis. Exp). (2015).
يوضح هذا الفيديو طريقة إيصال الجينات بواسطة الفيروس المرتبط بالغدية (AAV) في شبكية فأر معدل وراثياً، يلي ذلك تشريح الأنسجة وصبغها لتقييم سلامة الغشاء المحدد الداخلي.
